張俊芝， 吳飛飛， 仇威王， 吳德群， b

(東華大學(xué) a． 紡織學(xué)院； b． 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室， 上海 201620)

聚(改性精氨酸/N-異丙基丙烯酰胺)水凝膠敷料的制備與性能

張俊芝a， 吳飛飛a， 仇威王a， 吳德群a， b

(東華大學(xué) a． 紡織學(xué)院； b． 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室， 上海 201620)

以改性精氨酸(M-Arg)和N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)為單體，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)為交聯(lián)劑，通過自由基共聚，并預(yù)載入抗菌劑洗必泰，制備出新型P(M-Arg/NIPAAm)系列水凝膠敷料．通過核磁共振(1H NMR)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、掃描電子顯微鏡(SEM)表征了M-Arg的結(jié)構(gòu)和水凝膠的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)；利用溶脹率測試、藥物累計釋放、抗菌測試研究了水凝膠敷料的溶脹及抗菌性能．研究結(jié)果表明：不同單體投料比合成的水凝膠敷料具有不同的溫敏性；新型P(M-Arg/NIPAAm) 水凝膠敷料具有良好的抗菌和藥物緩釋性能．

水凝膠敷料； 精氨酸； 洗必泰； 溫敏性； 藥物控釋

傷口愈合是一個動態(tài)的過程，而敷料的性能可以改變愈合的進展[1]．敷料作為傷口處理過程中的臨時覆蓋物，其主要功能是覆蓋、保護受損的皮膚并提供有利于傷口愈合的環(huán)境[2]．隨著生活水平的提高以及現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，人們逐漸推崇快速愈合和現(xiàn)代化傷口護理產(chǎn)品的設(shè)計[3]．濕性敷料因能夠保持適當(dāng)?shù)臐駶櫗h(huán)境，可以促進生長因子結(jié)合，加快表皮細胞遷移的速度，從而加快傷口的愈合，因此近年來得到飛速的發(fā)展[4]．水凝膠敷料作為濕性敷料的一種，其能夠不斷吸收創(chuàng)面滲出液，保持創(chuàng)面濕潤、清創(chuàng)和加快傷口愈合，因此受到人們的青睞．

氨基酸是構(gòu)成生物機體的重要物質(zhì)之一，也是構(gòu)建細胞、修建組織的基材，其生物相容性好并且在生理環(huán)境下可以降解．精氨酸作為氨基酸的一種，含有親水性的胍基和羧基基團，將精氨酸經(jīng)過改性處理合成親水性較好的兩性離子基團單體，可用于制備兩性離子基團水凝膠[5]以應(yīng)用于敷料領(lǐng)域，該特性可賦予敷料抗污、抗蛋白吸附功能.N- 異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)制備的水凝膠具有溫敏效性，這種水凝膠廣泛用于藥物控釋、組織工程等領(lǐng)域[6-7]．

洗必泰具有高效廣譜抗菌、抑菌能力，性能穩(wěn)定，對人體無害．其不僅能殺滅金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，同時對一些真菌和細菌芽孢也有抑制作用，已廣泛用于殺菌劑并用作典型的防腐劑長達30多年[8]．

本文根據(jù)改性精氨酸(M-Arg)和NIPAAm單體的特點，制備生物相容性良好的P(M-Arg/NIPAAm)系列抗菌水凝膠敷料．因M-Arg單體的分子鏈上含有陽離子和陰離子基團的兩性電解質(zhì)，使其制備的P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料具有良好的水溶性和生物相容性．以N，N- 亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)作為交聯(lián)劑，在過硫酸銨(APS)引發(fā)劑、 N， N， N’， N’- 四甲基乙二胺(TEMED)催化劑的作用下，M-Arg與NIPAAm單體通過自由基共聚合成一種復(fù)合水凝膠敷料．同時以預(yù)載藥的方式，將廣譜抗菌藥物洗必泰載入該敷料，以制備P(M-Arg/NIPAAm) 系列抗菌水凝膠敷料，并研究了其溫敏性及長效釋藥等一系列性能．

1 試驗部分

1．1 原料

氯化鈉、二氯甲烷、甲醇、碳酸氫鈉均為分析純，甲基丙烯酸酐、 NIPAAm、 BIS、 APS、 TEMED為化學(xué)純，上述試劑均購于中國試劑網(wǎng)．L- 精氨酸，化學(xué)純，吉爾生化上海有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，上海酶聯(lián)生物科技；洗必泰，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；瓊脂，生物純，中國惠興生化試劑有限公司；大腸桿菌(E．coli ATCC 8099) 和金黃色葡萄球菌(S．a(chǎn)ureus ATCC 6538)，南京便診生物科技有限公司．

1．2 M-Arg單體的制備

M-Arg單體的合成過程如圖1所示.準(zhǔn)確稱取精氨酸17．4 g、碳酸氫鈉16．8 g、甲基丙烯酸酐18．5 g及100 mL蒸餾水．將精氨酸、碳酸氫鈉、100 mL蒸餾水置于250 mL兩頸圓底燒瓶中，0 ℃條件下在磁力攪拌器上攪拌均勻，然后將甲基丙烯酸酐溶液置于恒壓分液漏斗中，0 ℃條件下逐滴滴入混合溶液中，隨后在常溫下攪拌充分反應(yīng)2 h，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH= 7．4[9]．當(dāng)反應(yīng)充分后，經(jīng)抽濾除去白色固體物質(zhì)，并用二氯甲烷不斷清洗以去除產(chǎn)物中的雜質(zhì)，最后將提純后的產(chǎn)物在-50 ℃真空條件下冷凍干燥48 h，得到白色固體粉末并儲存在-7 ℃條件下，產(chǎn)率為52．13%．

圖1 M-Arg單體的制備Fig．1 Preparation of the M-Arg monomer

1．3 P(M-Arg/NIPAAm)抗菌水凝膠敷料的制備

將總質(zhì)量為0．1 g(見表1)的M-Arg單體、NIPAAm單體在常溫下溶于2 mL蒸餾水中，隨后依次加入15 mg交聯(lián)劑BIS，4 mg洗必泰，待溶液完全溶解后，加入15 mg APS，最后將溶液置于模具中，并加入6 μL TEMED，使其充分反應(yīng)3 h，即制備成P(M-Arg/NIPAAm)抗菌水凝膠敷料．隨后，將該水凝膠敷料置于蒸餾水中不斷溶脹清洗48 h，以除去多余的化學(xué)殘留物、藥物及未反應(yīng)的單體．蒸餾水保留以測該載藥樣品的載藥量和載藥率．合成參數(shù)、產(chǎn)率、載藥量和載藥率如表1所示．

含有雙鍵的M-Arg和NIPAAm單體在BIS交聯(lián)劑下進行自由基聚合，在聚合過程中線性高分子鏈連接起來形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，合成示意圖如圖2所示，

表1 P(M-Arg/NIPAAm)抗菌水凝膠敷料合成Table 1 Preparation of the P(M-Arg/NIPAAm) antimicrobial hydrogel dressings

圖2 P(M-Arg/NIPAAm)抗菌水凝膠敷料制備Fig．2 Preparation of the P(M-Arg/NIPAAm) antimicrobial hydrogel dressings

1．4 結(jié)構(gòu)表征與性能測試

1．4．1 核磁共振(1H NMR)

將10 mg M-Arg單體置于核磁管中并溶解在2 mL D2O 中，采用AVANCE 400型核磁共振波譜儀進行1H NMR測試，確定M-Arg單體中H的歸屬．

1．4．2 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

用Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行表征．L- 精氨酸、M-Arg及水凝膠敷料樣品采用壓片法制樣，甲基丙烯酸酐采用液膜法制樣，測試并記錄550～4 000 cm-1范圍的光譜．

1．4．3 掃描電子顯微鏡(SEM)測試

通過TM 3000型掃描電子顯微鏡觀察水凝膠敷料的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)．樣品經(jīng)過液氮的冷卻，放置于凍干機中在真空及-50 ℃狀態(tài)下凍干2 d后用導(dǎo)電膠粘到樣品臺上，經(jīng)噴金制樣即可進行測試．

1．4．4 溶脹率測試

通過溶脹率測試表征P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料在PBS中的溶脹度與溫度之間的關(guān)系．測試具體步驟：稱取一定量凍干后的樣品放置于PBS(pH=7．4， 0．1 mol/L)中，分別置于20， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 55及60 ℃的恒溫水浴中溶脹24 h以達到溶脹平衡，然后將樣品取出，用濾紙吸去表面多余的水分，稱其質(zhì)量．不同溫度下水凝膠的溶脹率按式(1)進行計算.

(1)

式中：Q為溶脹率；ms為樣品在不同溫度下達到溶脹平衡時的質(zhì)量；md為凍干樣品的質(zhì)量．

1．4．5 藥物體外釋放

通過日立U-4100型紫外可見近紅外分光儀測試洗必泰吸光度，將樣品放入200 mL PBS(pH=7．4， 0．1 mol/L)中，然后置于37 ℃數(shù)顯恒溫振蕩水浴鍋中，每隔一段時間取出2 mL 溶液，并及時補充2 mL PBS， 在254 nm波長處分別測定其吸光度，同時制備5種不同濃度的洗必泰PBS溶液作為對照樣以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品在不同時間點的藥物累積釋放量．樣品的載藥量和載藥率同樣采取此法進行相關(guān)測試．

洗必泰的體外累計釋放率根據(jù)式(2)進行計算.

(2)

式中:K為洗必泰的累計釋放率；mt為釋放t時間后洗必泰的累計釋放量；m1為預(yù)載入水凝膠內(nèi)洗必泰的質(zhì)量．

水凝膠敷料的載藥量(RL)與載藥率(RE)根據(jù)式(3)和(4)進行計算.

(3)

(4)

式中：mL為水凝膠敷料內(nèi)的藥物質(zhì)量；m3為載藥水凝膠的凍干質(zhì)量．mL可由式(5)計算而得.

mL=m1-m2

(5)

式中：m2為載藥水凝膠敷料在蒸餾水中清洗溶脹48 h后蒸餾水中洗必泰的質(zhì)量．

1．4．6 抗菌性能測試

P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料的抗菌性能通過瓊脂平皿擴散法進行測試.具體為：向無菌平皿中傾注10 mL瓊脂培養(yǎng)基，使其凝結(jié)后往瓊脂平板上均勻涂上0．1 mL試驗菌液(108CFU/mL)，然后用鑷子將抗菌水凝膠敷料分別放于平皿中央，均勻地按壓在瓊脂培養(yǎng)基上，直到試樣和瓊脂培養(yǎng)基很好地接觸．將培養(yǎng)基倒置放于37 ℃恒溫箱中18～24 h．每個試樣至少測3處，按式(6)計算抑菌圈的寬度.

H=(D-d)/2

(6)

式中：H為抑菌圈寬度， mm；D為抑菌帶外徑的平均值， mm；d為試樣直徑， mm．

2 結(jié)果與討論

2．1 M-Arg的核磁共振譜結(jié)構(gòu)分析

M-Arg的1H NMR圖如圖3所示.各個H原子的歸屬：5．49和5．58(—CH=CH2)(f)； 4．1(—CH—)(e)； 1．48(─CH2─CH2─CH2─)(a)； 1．50(─CH2─CH2—CH2—) (b)； 3．1(—CH2—CH2—CH2—)(d)； 1．72(—CH3)(c)．

圖3 M-Arg單體的1H NMR圖Fig．3 1H NMR spectrum of the M-Arg monomer

2．2 M-Arg的傅里葉變換紅外光譜分析

L-精氨酸、 M-Arg及甲基丙烯酸酐的傅里葉變換紅外光譜圖如圖4所示．在圖4中，a曲線在1 783 和1 723 cm-1處屬于甲基丙烯酸酐兩個共軛羰基C=O 的反對稱與對稱振動峰；b曲線中，在1 654 cm-1處為酰胺Ⅰ帶吸收峰，在1 538 cm-1處為酰胺Ⅱ帶的吸收峰，在3 299 cm-1處為羧基O—H 的伸縮振動峰，在1 721 cm-1處為羧基C=O的的吸收峰；c曲線中，在3 256 cm-1處為羧基O—H的伸縮振動峰，在1 694 cm-1處是羧基C=O的的吸收峰．a(chǎn)曲線中兩個峰的消失以及b曲線中酰胺吸收峰的出現(xiàn)，表明甲基丙烯酸酐的酸酐基團與精氨酸的氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)生成了M-Arg單體．

圖4 L-精氨酸、M-Arg與甲基丙烯酸酐的紅外光譜圖Fig．4 FI-TR spectra of L-arginine， M-Arg and methacrylic anhydride

2．3 水凝膠的傅里葉變換紅外光譜分析

P(M-Arg/NIPAAm)系列水凝膠敷料的傅里葉變換紅外光譜圖如圖5所示．由圖5可知，該系列水凝膠的紅外光譜圖基本一致，在3 600～3 200 cm-1內(nèi)有一個很寬的吸收帶，為—NH—的吸收峰；3 068 cm-1處附近為次強酰胺帶的倍頻收縮振動峰；2 973 cm-1處附近為甲基的C—H振動峰；1 640 cm-1處附近為酰胺基的羰基C=O的收縮振動峰；1 544 cm-1處附近為C—N的收縮振動峰；1 461 cm-1處為—CH3的不對稱彎曲振動峰．1 387和1 367 cm-1處附近的峰為—CH(CH3)2上雙甲基的對稱振動耦合分裂而形成的峰，2 936和2 876 cm-1處附近的峰為次甲基的C—H的振動峰，這些峰的強度隨NIPAAm投料比的增加而增強．1 131 cm-1處附近的峰為C—C的收縮振動峰．

圖5 P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料紅外光譜圖Fig．5 FI-TR spectra of P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings

2．4 水凝膠敷料的表面形貌分析

P(M-Arg/NIPAAm)系列水凝膠敷料的SEM圖如圖6所示．水凝膠因化學(xué)鍵的交聯(lián)而形成三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)．同時在單體總質(zhì)量和交聯(lián)劑質(zhì)量相同時，水凝膠敷料隨著M-Arg單體投料比的增大，單位體積內(nèi)交聯(lián)鍵增多，交聯(lián)程度增大，因此平均孔徑也隨之逐漸減?。蓤D6可知， 水凝膠敷料1#的平均孔徑最大，3#的平均孔徑最小．

(a) 1#

(b) 2#

(c) 3#圖6 P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料SEM圖Fig．6 SEM images of the P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings

2．5 水凝膠敷料溶脹率測試

冷凍干燥樣品在PBS(pH=7．4， 0．1 mol/L)中位于不同溫度下的平衡溶脹率曲線如圖7所示．

圖7 水凝膠敷料溶脹率Fig．7 Swelling kinetics of the hydrogel dressings

由圖7可知，隨著M-Arg投料比的增加，樣品的平衡溶脹率愈小.這是由于隨著M-Arg單體投料比的增大，單位體積內(nèi)交聯(lián)鍵所占的百分比越大，交聯(lián)程度越大，因此溶脹能力下降．同時通過調(diào)節(jié)M-Arg/NIPAAm 的投料比，制備形成的水凝膠敷料1#與PNIPAAm水凝膠敷料相比，溶脹率增大．由圖7可知，水凝膠敷料1#在30～40 ℃范圍內(nèi)體積快速收縮加速了藥物的釋放.這是因為隨著親水性單體M-Arg的加入使水凝膠的親水性增強，水凝膠與水分子形成的氫鍵數(shù)目也隨之增加，因此需要更多能量來破壞這些氫鍵才能使高分子鏈重新聚集發(fā)生體積收縮[10]．而與水凝膠敷料1#相比，2#與3#溫敏效果并不顯著，這是因為NIPAAm單體含量較低．

2．6 藥物釋放測試

樣品的載藥量與載藥率如表1所示，載藥樣品在PBS(pH=7．4， 0．1 mol/L)中位于不同時間點的藥物累積釋放曲線圖如圖8所示．由圖8可知，在開始2 h內(nèi)，P(M-Arg/NIPAAm)系列載藥水凝膠敷料中的藥物會大量釋放.這是由于一些藥物附著在敷料的表面，當(dāng)敷料置于PBS(pH=7．4， 0．1 mol/L)中時，這些藥物迅速釋放出來．而載藥敷料1#藥物累積釋放量明顯大于2#與3#，主要歸結(jié)于1#交聯(lián)程度較低，水凝膠平均孔徑大以及在37 ℃時1#體積收縮率大，以致使洗必泰較為快速地釋放．

圖8 洗必泰在P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料內(nèi)的控制釋放Fig．8 Controlled chlorhexidine release from the P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings

2．7 水凝膠敷料抗菌性能

載藥樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌試驗圖和抑菌帶寬度如圖9和10所示．從圖9和10中可以看出，P(M-Arg/NIPAAm)載藥水凝膠敷料具有良好的藥物緩釋效果，第10 d仍具有明顯的抑菌帶．在同等條件下通過觀察水凝膠敷料的抑菌帶可以得出， 1#載藥水凝膠敷料抑菌帶明顯大于2#與3#.通過抗菌性能測試及分析抑菌帶可得，在相同條件下，1#載藥水凝膠敷料要比2#與3#抗菌性能好．

(a) 抗菌活性

(b) 抑菌圈寬度圖9 P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料對大腸桿菌的抗菌活性及抑菌圈寬帶Fig．9 Antimicrobial activity and zone of inhibition of the P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings against E.coli

(a) 抗菌活性

(b) 抑菌圈寬度圖10 P(M-Arg/NIPAAm)水凝膠敷料對金黃色葡萄球菌的抗菌活性及抑菌圈寬度Fig．10 Antimicrobial activity and zone of inhibition of the P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings against S.aurevs

3 結(jié) 語

本文以生物相容性良好的L-精氨酸為原料，經(jīng)過改性制備具有兩性離子基團的M-Arg單體，然后與NIPAAm按不同投料比經(jīng)自由基共聚制備生物相容性良好和具有溫敏性的P(M-Arg/NIPAAm)系列復(fù)合水凝膠敷料．為了提高敷料的抗菌性能，以預(yù)載藥方式載入具有廣譜抗菌效果的洗必泰．經(jīng)過溶脹測試表明，載藥水凝膠敷料1#對溫度具有敏感性，其溶脹率隨著溫度的升高而減小，在30～40 ℃范圍內(nèi)，收縮率較大則有利于藥物的快速釋放．在同等條件下通過藥物累積釋放曲線、抗菌試驗圖及抑菌帶分析可得，載藥水凝膠敷料1#與其他系列水凝膠敷料相比，前者具有更好的抗菌及藥物控釋性能．

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PreparationandPropertiesoftheHydrogelDressingsBasedonPoly(ModifiedL-arginineandN-isopropylAcrylamide)

ZHANGJunzhib，WUFeifeib，QIUWeiwangb，WUDequna， b

(a． Key Laboratory of Textile Science & Technology， Ministry of Education； b． College of Textiles，Donghua University， Shanghai 201620， China)

The novel P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings have been synthesized by free radical copolymerization of modified L-arginine (M-Arg) and N-isopropyl acrylamide (NIPAAm) monomers using N， N-methylene bisacrylamide as cross-linker， and preloaded in antibacterial agent chlorhexidine． The structures of the M-Arg and the interior morphological structure of hydrogel are characterized via nuclear magnetic resonance(1H NMR)， Fourier transformation infrared spectroscopy(FT-IR) and scanning electron microscope(SEM)． The properties of antibacterial and swelling kinetics of the hydrogel dressing are studied by swelling test， drug cumulative release and antibacterial tests． The results show that the hydrogel dressings with different monomer feed ratios have different thermoresponsive properties and the novel P(M-Arg/NIPAAm) hydrogel dressings have a long-term efficacy against bacterial as well as drug sustained-release properties．

hydrogel dressing； arginine； chlorhexidine； thermoresponsive； controlled drug release

1671-0444(2017)05-0674-07

2016-06-13

中央高?；A(chǔ)研究基金資助項目(16D110113)；浦江人才計劃基金資助項目(14PJ1400300)

張俊芝(1990—)，女，河南周口人，碩士研究生，研究方向為抗菌水凝膠敷料．E-mail：xxhhzz1234@163．com

吳德群(聯(lián)系人)，男，副教授，E-mail： dqwu@dhu．edu．cn

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(責(zé)任編輯：楊靜)