雷華明，李 偉

( 長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白多克隆抗體的制備及檢測(cè)

雷華明，李 偉

( 長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025 )

為實(shí)現(xiàn)黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的原核表達(dá)并制備其多克隆抗體，利用基因特異性引物從黃鱔肝臟cDNA中擴(kuò)增黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白的C端序列，亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建pET/Tf-C重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。利用Ni離子親和層析技術(shù)純化Tf-C蛋白，并免疫新西蘭兔制備多克隆抗體；通過(guò)間接ELISA技術(shù)和組織蛋白印跡對(duì)制備的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，成功構(gòu)建pET/Tf-C原核表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)了蛋白的表達(dá)和純化；制備的多克隆抗體效價(jià)大于1∶25 600，并能特異性地識(shí)別來(lái)源于黃鱔不同組織的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白。研究結(jié)果對(duì)黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

黃鱔; 轉(zhuǎn)鐵蛋白; 多克隆抗體; 制備

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, Tf)是存在于動(dòng)物血清中的一種重要鐵離子結(jié)合蛋白，在機(jī)體鐵離子代謝和平衡調(diào)節(jié)中起重要的作用[1]，還作用于呼吸、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等過(guò)程[2]。典型的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子是一條分子量約80 ku的單鏈多肽，由N端、C端和鉸鏈區(qū)組成[3]。魚(yú)類的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白在魚(yú)類健康養(yǎng)殖方面具有重要的應(yīng)用前景[4]。近幾年就有包括尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[5]、白氏文昌魚(yú) (Branchiostomabelcheri)[6]、斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)[7]和魚(yú)(Miichthysmiiuy)[8]等魚(yú)類的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因被克隆，其重組蛋白的鐵離子結(jié)合能力、抗菌活性及遺傳多樣性也成為重要的研究?jī)?nèi)容。黃鱔(Monopterusalbus)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛分布。開(kāi)展黃鱔免疫相關(guān)分子的研究對(duì)于黃鱔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。沈志民等[9]開(kāi)展了黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的初步分析。王博文等[10]從黃鱔血液中提取了血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，并對(duì)其分子量、表面形貌、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。但是，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)在體外重組表達(dá)黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因并制備其多克隆抗體的相關(guān)報(bào)道。

筆者通過(guò)構(gòu)建黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌(Escherichiacoli)表達(dá)重組蛋白，經(jīng)過(guò)親和層系技術(shù)純化該蛋白，同時(shí)免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，分析多克隆抗體的效價(jià)及特異性。將為進(jìn)一步研究黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白在鐵離子代謝和免疫系統(tǒng)中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

含黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的質(zhì)粒pE-Tf(本實(shí)驗(yàn)室保存)；限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA 聚合酶(大連寶生物)；T1感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1克隆載體、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(北京全士金)；IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(Proteintech公司)；DAB顯色試劑盒(武漢谷歌生物)；動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒(上海貝博生物)；Ni離子親和層系柱(上海七海生物)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室克隆的黃鱔轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(序列號(hào)：KF500526)，設(shè)計(jì)了基因特異性引物rc-F(5′-CGGGAATTCGAATGGTGTAATGTGGGC-3′)和rc-R (5′-CACGCGGCCGCCT GTCTGAGTGATTTCATGGC-3′)以擴(kuò)增轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的C端序列。上游引物添加了EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，而下游引物添加了NotⅠ酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)酶切后回收純化，與進(jìn)行同樣雙酶切的pET-28 a進(jìn)行T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增、雙酶切和序列測(cè)定驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET/Tf-C。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于50 μg/mL的卡那霉素平板上進(jìn)行37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于卡那霉素50 μg/mL的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、230 r/min搖培至指數(shù)生長(zhǎng)期后添加IPTG，至濃度為0.1 mmol/L，培養(yǎng)4 h。取適量菌液進(jìn)行超聲破碎，加入5×上樣緩沖液進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.4 重組蛋白的純化

將上述陽(yáng)性菌株按照1∶100的比例接種于1 L含有50 μg/mL的卡那霉素的新鮮液體培養(yǎng)基中200 r/min 37 ℃恒溫培養(yǎng)8 h。離心收集菌體，用50 mmol/L的PBS(pH 8.3)懸浮菌液，進(jìn)行超聲波破碎。超聲波破碎后收集沉淀部分，用裂解緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH=8.3)洗滌3次后，加入適量裂解緩沖液溶解，上清液經(jīng)過(guò)濾后用5 mL 的親和層析鎳柱His-Binding-Resin 進(jìn)行純化，純化的蛋白經(jīng)含6、3、1.5、0.5、0.1 mol/L的鹽酸胍緩沖液梯度透析復(fù)性后，使用透析袋濃縮，用BCA法測(cè)定蛋白含量。

1.5 多克隆抗體的制備

將500 μg經(jīng)純化的蛋白和等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行充分乳化后采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔。每次間隔1周，共免疫5次。自第2次免疫開(kāi)始，用500 μg融合蛋白混合不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)免疫后1周采全血分離抗血清，并于-80 ℃分裝保存。

1.6 多克隆抗體的效價(jià)分析

以純化的融合蛋白為包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清為陰性對(duì)照，將兔抗Tf-C蛋白多克隆抗體進(jìn)行1∶200～1∶51 200倍比稀釋，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺為底物顯色液，進(jìn)行間接ELISA分析。以免疫血清樣品D450值/陰性對(duì)照血清D450值≥2時(shí)為陽(yáng)性作為判定標(biāo)準(zhǔn)，制備的多克隆抗體的最大稀釋度作為該抗體的有效效價(jià)。

1.7 多克隆抗體特異性的Western Blot分析

首先將含有空白質(zhì)粒的菌株總蛋白、陽(yáng)性菌株總蛋白和純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進(jìn)行1∶200倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行多抗的特異性檢測(cè)。

利用動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取黃鱔肝臟、脾臟、肌肉、腸和血液共5種組織的總蛋白。取50 μg各組織總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進(jìn)行1∶200倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行多抗的特異性檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用含有限制性酶切位點(diǎn)的基因特異性引物rc-F和rc-R從pE-Tf質(zhì)粒上可擴(kuò)增993 bp的條帶，而對(duì)重組菌進(jìn)行的菌液PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)也可擴(kuò)增相符大小的片段(圖1a)。提取的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切結(jié)果獲得了1條約1000 bp的條帶和1條約5000 bp的條帶(圖1b)，結(jié)果表明，黃鱔Tf-C序列已經(jīng)成功克隆至pET-28a(+)中。

圖1 重組表達(dá)載體的驗(yàn)證

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的質(zhì)粒pET/Tf-C轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，用0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h后發(fā)現(xiàn)重組菌表達(dá)了1條約37 ku的蛋白條帶，與預(yù)期Tf-C分子量相符，主要以包涵體形式存在。進(jìn)一步將該菌株大量擴(kuò)繁超聲破碎后，進(jìn)行包涵體蛋白的純化和復(fù)性，12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用Ni-NTA瓊脂糖親和層系柱獲得的樣品蛋白所含雜帶較少，說(shuō)明最終純化的目的蛋白純度較高，可用于下一步的多抗制備(圖2)。

圖2 黃鱔Tf-C重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

ck1:空白質(zhì)粒菌株; ck2:重組菌未誘導(dǎo); 1:重組菌IPTG誘導(dǎo); 2:純化的Tf-C.

2.3 多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

純化的蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得的超免疫血清通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)D450(陽(yáng)性血清)/D450(陰性血清)≥2.1時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性血清的最高稀釋度為1∶25 600(圖3)。該結(jié)果表明，成功獲得了較高效價(jià)的兔抗Tf-C蛋白的免疫血清。

圖3 間接ELISA檢測(cè)多抗血清的效價(jià)

2.4 多克隆抗體的Western Blot檢測(cè)

多抗血清對(duì)純化重組蛋白特異性的檢測(cè)結(jié)果表明，自制的多抗可以與純化的蛋白只產(chǎn)生1條特異帶，而與陽(yáng)性重組菌的總蛋白產(chǎn)生較特異的反應(yīng)；空白質(zhì)粒的總蛋白并未與多抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明制備的多抗血清具備較好的特異性(圖4)。

圖4 Western Blot 分析多抗的特異性

CK:轉(zhuǎn)空白質(zhì)粒菌株總蛋白; 1:轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒菌株總蛋白; 2: 純化的Tf-C蛋白.

2.5 多抗與組織來(lái)源的總蛋白的特異性反應(yīng)檢測(cè)

為進(jìn)一步分析多抗是否與動(dòng)物組織總蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，將制備的多抗血清作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行了Western Blot分析。結(jié)果表明，制備的抗血清也可較特異性地與來(lái)源于黃鱔肝臟、脾臟、肌肉、腸和血液中的總蛋白產(chǎn)生特異性條帶，各組織帶型、大小一致，進(jìn)一步說(shuō)明制備的兔抗Tf-C血清具備良好的特異性和應(yīng)用價(jià)值(圖5)。

圖5 抗血清與組織蛋白的Western blot檢測(cè)

3 討 論

鐵離子代謝平衡對(duì)機(jī)體維持活性氧運(yùn)輸、電子傳遞和DNA合成等過(guò)程至關(guān)重要。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和其受體一起在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵離子代謝平衡及降低Fe3+離子轉(zhuǎn)化為Fe2+對(duì)細(xì)胞造成細(xì)胞毒性的解毒過(guò)程中具有重要作用；并且它們還是重要的免疫相關(guān)分子[11]。國(guó)內(nèi)外魚(yú)類育種學(xué)家已開(kāi)展了諸多魚(yú)類轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的分離、遺傳多樣性分析及與先天免疫關(guān)系等的研究[5-8,12]。魚(yú)體中的轉(zhuǎn)鐵蛋白也被認(rèn)為是抗菌性非特異性體液免疫機(jī)制的重要組成部分[13]。黃鱔作為我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，其健康養(yǎng)殖和可持續(xù)性發(fā)展受到了出血病等多種細(xì)菌性病害的影響[14]。黃鱔抗病分子育種的研究亟需分離和鑒定黃鱔免疫相關(guān)基因并開(kāi)展功能研究以應(yīng)用于養(yǎng)殖實(shí)踐。黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的分離和鑒定為這種需求提供了基本條件。

人類的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白結(jié)構(gòu)是由一個(gè)N端和一個(gè)C端及中間短小的鏈接區(qū)組成的兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的功能單位構(gòu)成的[15]。N端和C端都具有Fe3+的高親和性和可逆的結(jié)合位點(diǎn)；造成這個(gè)現(xiàn)象的原因很可能是因?yàn)樵缙诘霓D(zhuǎn)鐵蛋白基因進(jìn)行了加倍和融合，從而提高了鐵離子結(jié)合能力[16]。黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白也和其他脊椎動(dòng)物一樣具有N端和C端結(jié)構(gòu)。筆者利用其C端重組蛋白制備的多克隆抗體能夠特異性地識(shí)別各組織總蛋白中的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，一方面證實(shí)了血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的組織分布是較為廣泛的，另外一方面也提示只采用C端基因序列進(jìn)行重組表達(dá)蛋白進(jìn)而制備多抗是可行的。黃鱔血清Tf-C多克隆抗體的制備為進(jìn)一步研究黃鱔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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PreparationandIdentificationofPolyclonalAntibodyofSerumTransferrininSwampEelMonopterusalbus

LEI Huaming, LI Wei

( Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland，Ministry of Education，Yangtze University, Jingzhou 434025, China )

This study was performed to express swamp eel transferrin C-lobe inEscherichiacoliin swamp eelMonopterusalbusand to generate rabbit polyclonal antibody of the protein. A pair of primers was used to amplify the C-lobe sequence of swamp eel tranferrin gene from the liver cDNAs. Subsequently, the purified fragments were subcloned into pET 28a(+), and then, the constructed plamid was introduced into BL21(DE3). After it was induced and expressed, recombinant protein was purified by one step affinity chromatography with a Ni-NTA agarose column. New Zealand white rabbits were immunized with the purified protein to generate polyclonal antibodies. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied to examine the titers of the polyclonal antibody, and Western-blotting was used to detect the specificity of the antibody. Results showed that the titer of the polyclonal antibody was more than 1∶25 600 with indirect ELISA and combined specifically with the overexpressed protein inEscherichiacoliand crude proteins from different tissues of swamp eel. The polyclonal antibody with high affinity and specificity was generated successfully and used for further research on biological function of transferrin in fish.

Monopterusalbus; transferrin; polyclonal antibody; preparation

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.21.019

2016-03-08；

2016-05-12.

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510489007)；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開(kāi)放課題(KF2015016).

雷華明(1994—)男，本科生;研究方向:生化與分子生物學(xué). E-mail: 1049810861@qq.com.通訊作者:李偉(1976—)男, 副教授；研究方向:魚(yú)類分子生物學(xué). E-mail:wetli@yangtzeu.edu.cn.

S917.4

A

1003-1111(2017)02-0220-04