劉紅艷，熊 飛，段辛斌，田輝伍，劉紹平，陳大慶

( 1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223 )

紅唇薄鰍2個野生群體的遺傳多樣性研究

劉紅艷1，熊 飛1，段辛斌2，田輝伍2，劉紹平2，陳大慶2

( 1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223 )

采用9 個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對長江支流岷江下游厥溪和長江上游干流朱楊溪紅唇薄鰍的2個野生群體遺傳多樣性及遺傳分化情況進(jìn)行了研究。共檢測出73條等位基因，其中厥溪群體中有55條等位基因，朱楊溪群體中有69條等位基因，兩群體共有等位基因數(shù)為51條。厥溪群體和朱楊溪群體的平均等位基因數(shù)分別為6.111和7.667，平均觀測雜合度分別為0.665和0.668；平均期望雜合度分別0.684和0.712,平均多態(tài)性信息指數(shù)分別為0.621和0.656，從各參數(shù)結(jié)果來看，朱楊溪群體的遺傳多樣性水平高于厥溪。AMOVA結(jié)果顯示，大多數(shù)遺傳變異存在于紅唇薄鰍群體內(nèi)(98.68%)，群體間的遺傳變異為1.32%，固定系數(shù)不顯著?；蛄鳛?.42，表明兩群體間基因交流頻繁。UPGMA 聚類顯示，厥溪和朱楊溪群體中的個體相互混雜。這些結(jié)果表明長江上游厥溪和朱楊溪群體未出現(xiàn)遺傳分化。

紅唇薄鰍；微衛(wèi)星；遺傳多樣性

紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)，屬鯉形目、鰍科、薄鰍屬，為長江上游特有魚類[1]。在鰍科中個體較大，僅次于長薄鰍(L.elongata)，喜流水環(huán)境。20世紀(jì)80年代在長江上游干流及支流分布較廣泛，但隨著長江三峽工程的截流及金沙江梯級水電站的開發(fā)，破壞了其棲息地和產(chǎn)卵場的環(huán)境，加之環(huán)境污染、過度捕撈等原因，其天然資源量銳減[2-5]。目前關(guān)于紅唇薄鰍的研究資料相當(dāng)少，僅見紅唇薄鰍泌尿系統(tǒng)的組織學(xué)觀察[6]和種群生態(tài)與線粒體遺傳學(xué)的研究[7]。研究遺傳多樣性有助于了解物種的進(jìn)化歷史和種群恢復(fù)潛力，因此，為了有效保護(hù)和恢復(fù)紅唇薄鰍種群資源，有必要對其遺傳多樣性進(jìn)行研究。

微衛(wèi)星DNA是由2～6個核苷酸組成的核心單元串聯(lián)重復(fù)形成，廣泛分布于真核生物的整個基因組中，同一座位上，由于核心單元的重復(fù)數(shù)不同，在群體中表現(xiàn)出多態(tài)性[8-9]。目前，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于魚類種群遺傳學(xué)研究[10-14]。本研究利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)，對長江支流岷江下游厥溪和長江上游干流朱楊溪紅唇薄鰍的2個野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，查明其遺傳多樣性水平，遺傳分化和基因流情況，以期為紅唇薄鰍的保護(hù)和資源恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

2011年1月—2013年1月進(jìn)行長江上游紅唇薄鰍資源分布調(diào)查，樣品采集。樣本采集地為長江支流岷江下游的厥溪和長江上游干流的朱楊溪，其中厥溪樣本為19尾，朱楊溪樣本為30尾。剪取部分鰭條于95%乙醇中保存帶回實(shí)驗(yàn)室。取保存于乙醇中的鰭條組織，置于0.9%的生理鹽水浸泡約12 h(期間更換生理鹽水3～4次)，鰭條組織去除乙醇后，剪碎置于離心管中，然后加入DNA 提取緩沖液[0.4 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，2 mmol/L EDTA (pH 8.0) ]600 μL，終含量為2%的十二烷基硫酸鈉和終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蛋白酶 K，混勻后56 ℃消化5～6 h，期間取出混勻數(shù)次，DNA經(jīng)酚—氯仿抽提，2倍體積無水乙醇沉淀，75%酒精洗滌,滅菌蒸餾水溶解。獲得的DNA用核酸蛋白分析儀檢測其純度和質(zhì)量濃度，最終DNA模板質(zhì)量濃度定量在20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析

采用本實(shí)驗(yàn)室篩選的重復(fù)性穩(wěn)定、多態(tài)性好的9個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳研究，其中7個為紅唇薄鰍微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(LR26、LR27、LR31、LR33、LR34、LR35、LR37)[15]， 2個為同屬魚類長薄鰍的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(CB12和CB18)[16]。PCR反應(yīng)總體積為10 μL，包括Taq DNA 聚合酶0.5 U(Fermentas)，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，1×Buffer，引物0.2 μmol/L，DNA 模板約20 ng，補(bǔ)充滅菌蒸餾水到10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，接著進(jìn)行35個循環(huán)：94 ℃變性40 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)在PTC100型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物用非變性的8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，并通過銀染法進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)DNA Marker標(biāo)記和微衛(wèi)星DNA的遷移率，讀取各等位基因條帶。利用CONVERT 1.3.1軟件[17]，將各群體等位基因條帶矩陣轉(zhuǎn)化相關(guān)分子遺傳學(xué)軟件所需的格式。用Popgene 1.2軟件[18]計(jì)算各遺傳多樣性參數(shù)，包括各位點(diǎn)的等位基因數(shù)目、觀測雜合度、期望雜合度。用PIC-CALC 0.6軟件計(jì)算多態(tài)性信息指數(shù)。

分子變異方差分析用AMOVA軟件[19]計(jì)算，檢測群體內(nèi)和群體間的遺傳變異情況，計(jì)算中考慮微衛(wèi)星等位基因的大小差異，所有多重比較中的P值均進(jìn)行泊松校正。用Arlequin 3.1軟件[20]計(jì)算群體間遺傳距離。用 NTSYS[21]中的SHAN程序進(jìn)行UPGMA 聚類，構(gòu)建群體間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增

9個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在2個紅唇薄鰍群體中均表現(xiàn)為多態(tài)性。共檢測出73條等位基因，其中在厥溪群體中有55條等位基因，在朱楊溪群體中有69條等位基因，兩群體共有等位基因數(shù)為51條。每個位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)分別為2～12不等,平均值為8.111。引物L(fēng)R35的在朱楊溪群體中的等位基因數(shù)最多，為12條，引物CB12在厥溪群體中的等位基因數(shù)最少，為2條(表1)。

2.2 遺傳多樣性

厥溪和朱楊溪的平均等位基因數(shù)分別為6.111和7.667，平均觀測雜合度分別為0.665和0.668，平均期望雜合度分別0.684和0.712，平均多態(tài)性信息指數(shù)分別為0.621和0.656(表1)?？梢钥闯觯鞐钕后w各遺傳多樣性參數(shù)均高于厥溪群體的，表明朱楊溪群體的遺傳多樣性水平高于厥溪。

表1 紅唇薄鰍群體微衛(wèi)星多態(tài)性數(shù)據(jù)

2.3 遺傳變異與聚類分析

厥溪和朱楊溪的Nei′s遺傳距離為0.0633，遺傳相似指數(shù)為0.9367，2個群體間的遺傳距離較小，遺傳相似度較高。分子方差分析(表2)顯示，大多數(shù)遺傳變異存在于紅唇薄鰍群體內(nèi)(98.68%)，群體間的遺傳變異為1.32%，固定系數(shù)遺傳分化指數(shù)不顯著，表明厥溪和朱楊溪群體未出現(xiàn)遺傳分化。基因流為9.42，表明2個群體間基因交流頻繁。

表2 紅唇薄鰍群體分子變異方差分析

UPGMA 聚類圖顯示(圖1)，厥溪和朱楊溪群體中的個體相互混雜，并未按相應(yīng)的地理位置進(jìn)行聚類，表明這2個長江上游群體沒有出現(xiàn)明顯的遺傳分化。

圖1 基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類圖

3 討 論

3.1 紅唇薄鰍群體的遺傳多樣性

厥溪和朱楊溪的平均等位基因數(shù)分別為6.111和7.667個，這與DeWoody等[22]得出的淡水魚類微衛(wèi)星等位基因數(shù)目約為7.5個的結(jié)論接近。同時，多態(tài)信息指數(shù)也是衡量基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)多態(tài)信息指數(shù)>0.5 時，該座位為高度多態(tài)性；當(dāng)0.25<多態(tài)信息指數(shù)<0.5 時, 該座位為中度多態(tài)性；當(dāng)多態(tài)信息指數(shù)<0.25 時，該座位為低度多態(tài)性[23]。在厥溪群體和朱楊溪群體微衛(wèi)星位點(diǎn)中有3個中度多態(tài)性位點(diǎn)(LR31、CB12和CB18)，其余6個位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)。從本研究選用的9 個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的多態(tài)性來看，紅唇薄鰍2個野生群體的多態(tài)信息含量較高，屬于中度及高度多態(tài)性，這說明紅唇薄鰍的等位基因多樣性較為豐富。

雜合度是指群體在多個基因座上遺傳變異的表現(xiàn)，被認(rèn)為是評價群體的遺傳多樣性的一個最適參數(shù)，按照Hardy-Weinberg定理，雜合度在隨機(jī)交配群體中≤0.5[24]。本研究中，2個紅唇薄鰍群體的觀測雜合度和期望雜合度均大于0.5，表明紅唇薄鰍發(fā)生近交的可能性不大。紅唇薄鰍2個群體的平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.667及0.698，低于同喜流水生活的長江宜賓圓口銅魚(Coreiusguichenoti)(觀測雜合度0.753, 期望雜合度0.728)[25]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)(觀測雜合度0.805)[26]的雜合度，高于長江水系的草魚(Ctenopharyngodonidellus)(觀測雜合度0.4000～0.5741，期望雜合度0.4773～0.6489)[26]、鯉魚(Cyprinuscarpio)(期望雜合度0.267～0.419)、銅魚(C.heterokon)(觀測雜合度0.4251～0.5158)等魚類的雜合度[28]，表明紅唇薄鰍的群體遺傳多樣性比較豐富，有著較大的進(jìn)化適應(yīng)的潛力，這與田輝伍利用線粒體Cyt b和控制區(qū)DNA研究結(jié)果一致[7]。

3.2 紅唇薄鰍基因流和遺傳分化

紅唇薄鰍2個群體間的遺傳距離較小，這說明2個群體間的遺傳相似程度較高。分子方差分析也顯示，2個群體間遺傳變異只占總遺傳變異的較小的比例(1.32%)，并且遺傳分化指數(shù)值不顯著，也說明紅唇薄鰍群體間差異較小，遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)。UPGMA也支持厥溪和朱楊溪群體沒有出現(xiàn)遺傳分化，這2個群體均屬于同一種群。這可能與紅唇薄鰍的生活習(xí)性和產(chǎn)卵習(xí)性有關(guān)，紅唇薄鰍屬于喜流水環(huán)境的魚類，在繁殖季節(jié)，親魚有上溯到相應(yīng)的產(chǎn)卵場習(xí)性，產(chǎn)漂流性卵，卵隨著河水向下漂流孵化，而后其幼魚和成魚則溯流回到上游，因而在這個過程中，各分布區(qū)群體之間有更多的遺傳交流機(jī)會。本研究中基因流較大，也證明了群體間的基因交流頻繁。這與線粒體Cyt b和控制區(qū)DNA的研究結(jié)果一致[7]。與紅唇薄鰍有著相似生活習(xí)性和同為產(chǎn)漂流性卵的中華沙鰍(Botiasuperciliaris)在長江上游也未出現(xiàn)群體的遺傳分化[29]。另外，產(chǎn)漂流性卵的銅魚、圓口銅魚和草魚也未發(fā)生顯著的遺傳分化[27-28,30-31]。

3.3 種質(zhì)保護(hù)

本研究中，雖然2個紅唇薄鰍群體都保持了較高的遺傳多樣性, 但朱楊溪群體的遺傳多樣性水平要顯著高于厥溪群體，說明岷江厥溪群體遺傳資源已遭到了一定程度的破壞，需要加強(qiáng)保護(hù)。目前紅唇薄鰍資源量正在不斷地減少，長江上游梯級大壩的開發(fā)仍在持續(xù)的進(jìn)行，大壩的建立將限制紅唇薄鰍上下游群體之間的遺傳交流，極大的改變水文條件，破壞其棲息地和產(chǎn)卵場，紅唇薄鰍生存前景不容樂觀，亟需進(jìn)行長江特有物種的保護(hù)。物種的保護(hù)必須充分考慮到物種的遺傳特征，本研究結(jié)果顯示紅唇薄鰍群體間沒有顯著遺傳分化，可作為1個遺傳單元來進(jìn)行保護(hù)和管理。大壩截流后水庫的形成，使原來的流水環(huán)境變成靜水環(huán)境，鑒于紅唇薄鰍獨(dú)特的喜流水生活習(xí)性，有必要擴(kuò)大采樣范圍和樣本量進(jìn)一步全面深入的研究紅唇薄鰍遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性，以便為其種質(zhì)資源的保護(hù)、管理以及種群恢復(fù)提供更加可靠的科學(xué)依據(jù)。

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GeneticDiversityinTwoWildPopulationsofRedlipLoachLeptobotiarubrilabris

LIU Hongyan1, XIONG Fei1, DUAN Xinbin2, TIAN Huiwu2, LIU Shaoping2, CHEN Daqing2

( 1. School of Life Sciences, Jianghan University, Wuhan 430056, China; 2.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223,China )

Genetic diversity and genetic differentiation were investigated by 9 microsatellite loci in two wild populations (Juexi population and Zhuyangxi population) of redlip loachLeptobotiarubrilabrisin the upper reaches of the Yangtze River. A total of 73 alleles was detected, with 55 alleles in Juexi population and 69 alleles in Zhuyangxi population, in which 51 alleles were shared. The average number of alleles in Juexi and Zhuyang were 6.111 and 7.667, average observed heterozygosity 0.665 and 0.668, average expected heterozygosity 0.684 and 0.712, and the average polymorphism information index 0.621 and 0.656. These genetic parameters indicated that there was higher level of genetic diversity in Zhuyangxi than that in Juexi. AMOVA analysis revealed that most of the total variation occurred within populations (98.68%)，a small amount of differentiation among populations (1.32%), without significance in Fst value (0.0132). The Nm value of 9.42 indicated that gene flow between the two sites was frequently. UPGMA clustering revealed that the individuals mixed together. The findings reflected that there was no significant differentiation in populations of redlip loach in the upper reaches of the Yangtze River.

Leptobotiarubrilabris; microsatellite; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.013

2016-04-16；

2016-06-29.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51109091)；江漢大學(xué)出國留學(xué)基金資助項(xiàng)目.

劉紅艷(1978-)，女，副教授；研究方向：魚類分子遺傳. E-mail:lhy9603@126.com. 通訊作者： 段辛斌(1972-)，男，副研究員；研究方向：魚類資源學(xué). E-mail: duan@yfi.ac.cn.

S965.199

A

1003-1111(2017)02-0192-05