李夢云 姚國佳 楊建平 姬向波 劉 健 張曉根

(1.河南牧業(yè)經濟學院飼料工程中心，鄭州 450046；2.鄭州輕工業(yè)學院，鄭州 450002)

夏季高溫條件下飼糧中添加刺梨提取物對皖西白鵝生長性能、脂質代謝及肝臟中熱休克蛋白70基因表達的影響

李夢云1姚國佳1楊建平1姬向波1劉 健1張曉根2*

(1.河南牧業(yè)經濟學院飼料工程中心，鄭州 450046；2.鄭州輕工業(yè)學院，鄭州 450002)

本試驗旨在研究夏季高溫條件下飼糧中添加刺梨提取物對皖西白鵝生長性能、脂質代謝及肝臟中熱應激蛋白70(HSP70)基因表達的影響。挑選28日齡、體重相近的健康皖西白鵝150只，隨機分成3組，即對照組、試驗1組和試驗2組，每組5個重復，每個重復10只鵝。對照組試驗鵝飼喂基礎飼糧，試驗1組和試驗2組試驗鵝分別飼喂在基礎飼糧中添加100和200 mL/kg刺梨提取物的試驗飼糧。預試期7 d，正試期14 d，試驗期間最高氣溫37 ℃，最低氣溫24 ℃，日平均氣溫31.6 ℃。飼喂2周后，每個重復挑選1只鵝屠宰，采集血樣，并分離出肝臟，測定血清脂質代謝指標和肝臟中HSP70基因的相對表達量。結果表明：飼糧中添加刺梨提取物對皖西白鵝的平均日采食量和平均日增重均無顯著影響(P>0.05)，但添加200 mL/kg刺梨提取物可顯著降低料重比(P<0.05)；飼糧中添加100和200 mL/kg刺梨提取物均可顯著提高血清高密度脂蛋白含量(P<0.05)，但對血清總膽固醇和甘油三酯含量無顯著影響(P>0.05)；與對照組相比，試驗1組和試驗2組肝臟中HSP70基因的相對表達量均極顯著提高(P<0.01)，同時試驗1組肝臟中HSP70基因的相對表達量還極顯著高于試驗2組(P<0.01)。由此得出，在夏季高溫條件下，在皖西白鵝飼糧中添加刺梨提取物可提高飼料轉化率、調節(jié)脂質代謝、上調肝臟中HSP70基因的表達，具有較明顯的抗應激效果，且添加量為100 mL/kg時的抗應激效果優(yōu)于添加量為200 mL/kg時。

皖西白鵝；刺梨提取物；生長性能；脂質代謝；HSP70基因表達

刺梨(RosaroxburghiiTratt.，RRT)是一種主要來源于我國南方地區(qū)的薔薇屬野生藥用植物。研究表明，刺梨果實具有提高機體免疫力和抗疾病的作用，對粥樣硬化[1]、胃癌[2]、卵巢癌[3]等疾病具有明顯的抑制作用。同時，刺梨富含維生素、微量元素、氨基酸、刺梨多糖等多種化學成分及活性成分[4-5]，常用于促進機體健康和保健。特別引人關注的是，每100 g刺梨鮮樣中維生素C含量達到了664～2 601 mg，遠遠高于其他水果、蔬菜[6]，因而其可能具有抗應激作用。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，又稱為應激蛋白，是機體受到外界各種熱、冷等刺激時發(fā)生應激反應而產生的一類高度保守的蛋白質家族，在應激條件下參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程，保護細胞生命活動[7]。HSPs種類較多，其中熱休克蛋白70(HSP70)是最主要的應激蛋白，在熱應激過程中，HSP70表達量增加，耐熱細胞的耐熱性隨之增強，使機體免受損傷[8]。因此，HSP70的表達量可以作為一個潛在的環(huán)境應激標志物[9]。目前關于刺梨提取物在動物上的應用還比較少，特別是對鵝生長性能、脂質代謝的影響還未見報道，刺梨提取物是否可通過調控HSP70基因的表達來抵抗應激反應也未見報道。因此，本試驗擬研究在夏季高溫條件下飼糧中添加刺梨提取物對皖西白鵝生長性能、脂質代謝及肝臟中HSP70基因表達的影響，為刺梨提取物在動物上的應用提供數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

刺梨樣品購于開封市金維康野生植物開發(fā)有限公司，將刺梨干果粉碎，用紗布包裹(每包200 g)，在45 ℃條件下蒸餾水浸泡2 h，1∶10 料液比(40%乙醇)在超聲波裝置中50 ℃、40 kHz頻率、功率200 W超聲提取40 min，然后在溫度60 ℃、負壓(-0.08～-0.05 MPa)條件下在濃縮罐中進行濃縮，至初始提取液的55%左右，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取部分提取液檢測其維生素C、多酚和黃酮含量。

采用高效液相色譜法測定刺梨提取物中維生素C的含量：取少許經濃縮后的刺梨提取物，用布氏漏斗過濾，再準確量取1 mL刺梨提取物濾液于10 mL棕色容量瓶中，用1 g/L偏磷酸溶液定容，超聲5 min，分析前用0.45 μm濾膜過濾，具體測定方法參見王樂樂等[10]的方法。采用比色法[11]測定刺梨提取物中黃酮和多酚的含量。

1.2 試驗設計與試驗動物

挑選28日齡、體重相近的健康皖西白鵝150只，隨機分成3組，即對照組、試驗1組和試驗2組，每組5個重復，每個重復10只鵝。對照組飼喂基礎飼糧，試驗1組和試驗2組分別飼喂在基礎飼糧中添加100和200 mL/kg刺梨提取物的試驗飼糧。

1.3 試驗飼糧

基礎飼糧參照NRC(1994)鵝飼養(yǎng)標準以及我國養(yǎng)鵝實際生產水平設計，在基礎飼糧中分別添加100和200 mL/kg的刺梨提取物制成試驗飼糧，基礎飼糧和試驗飼糧營養(yǎng)水平相同。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kilogram of the diet：食鹽 NaCl 3 g，50%膽堿 50% choline 1 g，賴氨酸Lys 1 g，VA 10 000 IU，VD 32 500 IU，VE 50 mg，VK 4.5 mg，VB120.28 mg，VB18.75 mg，VB61.7 mg，煙酸 niacin 35 mg，泛酸 pantothenic acid 13 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 0.047 mg，Cu 150 mg，Zn 100 mg，F(xiàn)e 130 mg，Mn 30 mg，I 0.35 mg，Se 0.25 mg。

2)所有指標均為計算值。All indices were calculated values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在河南牧業(yè)經濟學院動物試驗基地進行，整個試驗期21 d，從2015年7月12日開始，至2015年8月2日結束，其中預試期7 d，正試期14 d，試驗期間最高氣溫37 ℃，最低氣溫24 ℃，日平均氣溫31.6 ℃。試驗鵝進行地面平養(yǎng)，自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進行。試驗期每天記錄溫度，并以重復為單位記錄采食量，在上、下午觀察鵝群健康狀況。試驗結束后，每個重復挑選1只鵝屠宰，采集血樣，并分離出肝臟，測定血清指標和肝臟中HSP70基因相對表達量。

1.5 測試指標與方法

1.5.1 生長性能測定

試驗期間準確記錄每個重復鵝每日采食量，然后計算出整個正試期內的平均日采食量；試驗開始前和試驗結束后分別空腹稱重，計算出平均日增重和料重比。

1.5.2 血清脂質代謝指標測定

試驗結束后，每個重復各挑選1只鵝，稱重后屠宰時采血10 mL，靜置、凝固后置于離心機中以 3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清置于EP管中，在-20 ℃保存，測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)活性及高密度脂蛋白(HDL)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量，所有指標均由鄭州市第五人民醫(yī)院檢驗科測定。

1.5.3 肝臟中HSP70基因相對表達量的測定

采集血樣后的鵝分離出肝臟，每只鵝取30 mg肝臟樣品在液氮中充分研磨，收集于1.5 mL EP管中，用RNA提取試劑盒(SK1312，上海生工生物工程有限公司)提取總RNA，具體過程按試劑盒操作說明進行。將提取的總RNA作為模板，用cDNA合成試劑盒(SK2445，上海生工生物工程有限公司)進行反轉錄(RT)反應。反應體系：總RNA 5 μL、OligodT引物1 μL、RNA酶抑制劑1.0 μL(20 U/μL)、dNTP Mixture 2 μL(10 mmol/L)、5×RT緩沖液4 μL、反轉錄酶2 μL(10 U/μL)、無RNA酶去離子水5 μL，總體積為20 μL。按70 ℃ 5 min、冰浴10 s、37 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min的程序在Mastercycler Gradient PCR儀中進行RT反應。RT反應完成后立即進行定量PCR反應。目的基因HSP70和內參基因β-肌動蛋白(β-actin)的引物序列由上海生工生物工程有限公司設計并合成，HSP70基因的引物序列為：上游引物，5′-AGCAGCTATCCTCATGGGAGA-3′；下游引物，5′-TGGTGGGAATGGTGGTGTTA-3′。β-actin基因的引物序列為：上游引物，5′-AGTGTCTTTTTGTATCTTCCGCC-3′；下游引物，5′-CCACATACTGGCACTTTACTCCTA-3′。定量PCR反應體系總體積為20 μL，反應體系如下：cDNA 2 μL、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、上游引物與下游引物(10 μmol/L)各1 μL、0.1% DEPC處理水6 μL。定量PCR反應程序如下：95 ℃ 3 min，然后95 ℃ 30 s(共40個循環(huán))，最后70 ℃延伸5 min。分別測得目的基因HSP70和內參基因β-action的Ct值，采用2-??Ct法計算HSP70基因的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行方差分析，并采用LSD法進行多重比較。數(shù)據表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 刺梨提取物活性組分含量

表2為刺梨提取物中維生素C、多酚和黃酮的含量，數(shù)據表明刺梨提取物中維生素C含量較高，達到了90.9 mg/g DM。

表2 刺梨提取物中活性組分含量

2.2 刺梨提取物對皖西白鵝生長性能的影響

表3為刺梨提取物對皖西白鵝生長性能的影響。由表中數(shù)據可知，飼糧中添加100和200 mL/kg刺梨提取物對鵝平均日采食量和平均日增重均無顯著影響(P>0.05)，但添加200 mL/kg刺梨提取物可顯著降低料重比(P<0.05)。

2.3 刺梨提取物對皖西白鵝血清指標的影響

表4為刺梨提取物對皖西白鵝血清指標的影響。由表中數(shù)據可知，與對照組相比，試驗1組和試驗2組血清高密度脂蛋白含量均顯著提高(P<0.05)，但血清總膽固醇和甘油三酯含量無顯著變化(P>0.05)，表明刺梨提取物可能參與機體內脂質代謝。另外，表中數(shù)據還表明，各組間血清谷丙轉氨酶活性無顯著差異(P>0.05)。

2.4 刺梨提取物對皖西白鵝對肝臟HSP70基因相對表達量的影響

表5數(shù)據表明，試驗2組肝臟中HSP70基因的相對表達量極顯著低于試驗1組(P<0.01)，但和對照組相比，試驗1組和試驗2組肝臟中HSP70基因的相對表達量均極顯著提高(P<0.01)，說明機體抗應激特別是抗熱應激能力增強，這表明刺梨提取物對鵝具有較明顯的抗應激效果。

表3 刺梨提取物對皖西白鵝生長性能的影響

同行數(shù)據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表4 刺梨提取物對皖西白鵝血清指標的影響

表5 刺梨提取物對皖西白鵝肝臟HSP70基因相對表達量的影響

3 討 論

3.1 刺梨提取物對皖西白鵝生長性能的影響

關于刺梨提取物對動物生長性能的影響，目前研究較少且試驗結果也不盡相同。張曉玲[12]在大鼠上的研究表明，灌胃100 mg/kg刺梨提取物4周后，對大鼠采食量和平均日增重無顯著影響。楊建平等[13]的研究表明，在肉仔雞飼糧中分別添加100和150 mL/kg刺梨提取物，均可顯著提高平均日增重和平均日采食量，其原因可能在于刺梨粗提物中的多酚、有機酸等活性成分促進了消化器官對消化液的分泌，增加了食欲，從而改善消化器官的消化能力[14]。本試驗結果表明，飼料中添加100 mL/kg刺梨提取物后有提高平均日采食量的趨勢，但差異沒有達到顯著水平。造成上述研究結果差異的原因除了動物品種不同外，還可能在于本試驗是在7月份進行，天氣炎熱，會對采食量有一定的抑制作用，而且本飼養(yǎng)試驗只進行了2周，也可能會影響到生長性能。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，當飼糧中添加200 mL/kg刺梨提取物時，可顯著降低料重比，可能是由200 mL/kg刺梨提取物組的平均日采食量相對低于100 mL/kg刺梨提取物組而平均日增重兩組間無顯著差異所致，刺梨提取物對動物生長性能的影響還有待于進一步的研究。

3.2 刺梨提取物對皖西白鵝脂質代謝的影響

戴堯天等[15]報道了刺梨汁對脂質代謝具有調控作用，其研究發(fā)現(xiàn)，給鵪鶉飼喂4周的刺梨汁可顯著提高血漿總膽固醇含量，血漿甘油三酯的含量也有所增加，但差異不顯著，同時還有降低血漿高密度脂蛋白含量的趨勢，其課題組論述刺梨對脂質代謝的調控可能基于其富含黃酮類(60 mg/g)活性物質。謝棒祥等[16]也證實在肉仔雞飼糧中添加不同水平的類黃酮均可顯著降低血清總膽固醇和甘油三酯含量，同時顯著提高血清高密度脂蛋白含量。張曉玲[12]檢測了刺梨中黃酮類活性物質的成分及其含量，并且發(fā)現(xiàn)灌胃100 mg/kg刺梨提取物4周后正常大鼠的血清甘油三酯含量顯著降低，對其他血清生化指標無顯著影響。本試驗測定的刺梨提取物中黃酮含量為41.05 mg/g DM，并發(fā)現(xiàn)刺梨提取物可顯著增加血清高密度脂蛋白含量。高密度脂蛋白可運載周圍組織中的膽固醇至肝臟進行分解代謝，轉化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出，以降低血清膽固醇含量，因此高密度脂蛋白可抑制動脈粥樣硬化[17]。這可能是刺梨抗動脈粥樣硬化的原因之一。

3.3 刺梨提取物對皖西白鵝肝臟HSP70基因表達的影響

HSP70是一種抗應激蛋白，應激狀態(tài)下在細胞內迅速合成，抵抗應激造成的組織細胞損傷，提高機體的熱耐受能力而起到保護機體的作用[18]。關于刺梨提取物對鵝肝臟HSP70基因表達的研究目前還未見報道。最近的研究表明，一些抗熱應激中藥可通過提高HSP70基因的表達來改善機體抗應激能力[19]。刺梨是一種藥用植物，且維生素C含量極高，何照范等[6]研究表明每100 g刺梨鮮樣中維生素C含量達到了664～2 601 mg，遠遠高于其他的水果、蔬菜，因而推測刺梨可能會有抗應激的作用。Joseph等[20]論述了維生素C在炎熱夏季可以減緩肉仔雞熱應激。韓喜彬等[21]的研究表明，在小鼠飲水中添加維生素C可上調HSP70的表達，從而緩解熱應激。本試驗也表明，給皖西白鵝飼糧中添加100和200 mL/kg刺梨提取物均可極顯著提高肝臟中HSP70基因的相對表達量，從而緩解夏天高溫條件下引起的熱應激。同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)200 mL/kg刺梨提取物組肝臟中HSP70的相對表達量盡管極顯著高于對照組，但卻極顯著低于100 mL/kg刺梨提取物組，原因可能在于過量添加刺梨提取物對動物有一定的毒性，而且刺梨提取物的添加量越大，采食的維生素C的量就越多，而補充過高劑量的維生素C會抑制HSP70基因的表達[22]。刺梨提取物對抗熱應激基因HSP70表達的影響還有待于進一步研究。

4 結 論

綜上所述，夏季高溫條件下在皖西白鵝飼糧中添加刺梨提取物可提高飼料轉化率、調節(jié)脂質代謝、上調抗應激基因HSP70的表達，因而具有抗熱應激效果，且刺梨提取物添加量為100 mL/kg時的抗應激效果優(yōu)于添加量為200 mL/kg時。

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EffectsofRosaroxburghiiTratt.ExtractonGrowthPerformance,LipidMetabolismandHeatShockProtein70GeneExpressioninLiverofWanxiWhiteGeeseunderHighTemperatureinSummer

LI Mengyun1YAO Guojia1YANG Jianping1JI Xiangbo1LIU Jian1ZHANG Xiaogen2*

(1.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450046,China; 2.ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou450002,China)

The aim of this study was to investigate the effects ofRosaroxburghiiTratt. (RRT) extract on growth performance, lipid metabolism and heat shock protein 70 (HSP70) gene expression in liver ofWanxiwhite geese under high temperature in summer. One hundred and fifty 28-day-oldWanxiwhite geese with the similar body weight were randomly allotted to three groups including control group, trial group 1 and trial group 2, and each group had 5 replicates and each replicate had 10 geese. The geese in control group were fed a basal diet, and geese in trial group 1 and trial group 2 were fed experimental diets which supplemented with 100 and 200 mL/kg RRT extract in the basal diet, respectively. The pre-test period lasted for 7 days, and the experimental period lasted for 14 days. During the experiment, the highest temperature was 37 ℃, the lowest temperature was 24 ℃, and the average daily temperature was 31.6 ℃. After feeding two weeks, one goose in each replicate was selected and slaughtered, and then the blood samples were collected to measure serum lipid metabolism indices and the liver samples were separated to measure liverHSP70 gene relative expression level. The results showed that no significant differences were found in the average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) among three groups (P>0.05), however, the gain/feed (F/G) was significantly improved when diet supplemented with 200 mL/kg RRT extract (P<0.05). Diet supplemented with 100 and 200 mL/kg RRT extract could increase the serum high-density lipoprotein (HDL) content (P<0.05), whereas serum total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) contents were not significantly affected by RRT extract supplementation (P>0.05). Compared with the control group, the relative expression level ofHSP70 gene in liver of trial group 1 and trial group 2 was extremely significantly increased (P<0.01), and trial group 1 was extremely significantly higher than trial group 2 (P<0.01). From above results, it can be concluded that RRT extract supplemented into the diet ofWanxiwhite geese can improve the feed conversion rate, regulate lipid metabolism and up-regulate liverHSP70 gene expression, so it has obvious anti-stress effect under high temperature in summer, and the anti-stress effect of 100 mL/kg RRT extract is better than that of 200 mL/kg RRT extract.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4518-4524]

Wanxiwhite geese;RosaroxburghiiTratt. extract; growth performance; lipid metabolism;HSP70 gene expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.033

S816

A

1006-267X(2017)12-4518-07

2017-05-26

河南省重大科技攻關項目(122101110300)；校科技創(chuàng)新團隊(HUAHE2015005)

李夢云(1970—)，女，湖北監(jiān)利人，副教授，博士，從事動物營養(yǎng)研究。E-mail: limengyun1@163.com

*通信作者：張曉根，教授，碩士生導師，E-mail： zxgwcm_666@sina.com

*Corresponding author, professor, E-mail： zxgwcm_666@sina.com

(責任編輯 菅景穎)