李 航，劉俊平，關(guān)平原，雷 宇，李 志

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

貓皰疹病毒Ⅰ型PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

李 航1，劉俊平*，關(guān)平原*，雷 宇2，李 志3

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

建立貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR檢測方法，應(yīng)用于臨床樣品中FHV-1的快速檢測。根據(jù)貓皰疹病毒Ⅰ型的gI基因序列設(shè)計了一對特異性引物，以疑似貓皰疹病毒Ⅰ型感染貓的眼鼻分泌物總DNA為模板，建立了PCR檢測方法，對所建立的方法進行特異性、敏感性和重復(fù)性驗證，并對26份臨床樣本進行檢測。結(jié)果表明，所建立的PCR診斷方法與犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、綿羊肺炎支原體(M.ovis)、牛支原體(M.bovis)、牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均無交叉性反應(yīng)，最低檢測DNA模板濃度為3.23×103copies/μL。對26份臨床病例進行檢測，陽性率61.54%。說明建立的FHV-1 PCR檢測方法具有特異性強、敏感度高、方便快捷等優(yōu)點，適合于臨床FHV-1感染的快速檢測。

貓；貓皰疹病毒Ⅰ型；PCR檢測

貓鼻氣管炎又稱貓病毒性鼻氣管炎(Feline viral rhinotracheitis，F(xiàn)VR)或貓傳染性鼻氣管炎,該病的病原是皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘屬中貓皰疹病毒Ⅰ型 ( Feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1)[1]。該病可引起貓科動物急性、高度接觸性上呼吸道疾病，主要侵害幼貓，發(fā)病率達100%，病死率約50%，是目前已知最重要的貓呼吸道疾病之一[2]。自1957年Crandell R A于美國首次在患病幼貓體內(nèi)分離得到FHV-1后，世界各地相繼分離到該病毒，我國也多次發(fā)現(xiàn)疑似病例并分離到病毒[3-5]。血清學(xué)調(diào)查表明，20世紀90年代我國貓群中即有FHV-1感染[6]。該病毒具有高度種屬特異性,只感染貓科動物，相關(guān)研究表明該病毒可感染野貓、獵豹、東北虎等野生貓科動物，對野生動物保護造成嚴重危害。2012年-2014年我國相繼報道了東北虎、華南虎感染該病并致死的案例[7-8]。目前,我國FHV-1發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,多次發(fā)現(xiàn)臨床疑似病例[6]。但獸醫(yī)臨床還僅依靠傳統(tǒng)診斷方法，診斷結(jié)果不準確，實驗室診斷方法也主要靠病毒分離和血清學(xué)方法，雖有較準確的結(jié)果，但周期長，費用高。PCR檢測技術(shù)是目前診斷FHV-1較為理想的手段，因PCR方法具有基因組特定片段的靶向作用，能證實黏膜拭子中含有病毒DNA片段，故此PCR診斷方法被認為是診斷該病的“金標準”[9]。

本研究旨在通過設(shè)計特異性引物，建立特異、敏感、便捷的FHV-1 PCR檢測方法,為FVR的臨床診斷和檢疫提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血液/細胞、組織基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)購自天根(北京)生化科技有限公司；d NTP Mixture 50×TAE 電泳緩沖液、Premix ExTaq、DNA Marker DL 2 000、Amp、PMD19-T載體、大腸埃希菌感受態(tài)DH5α、PCR產(chǎn)物的純化回收試劑盒、重組質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠購自Promega公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 病料來源 疑似貓皰疹病毒Ⅰ型感染的貓鼻分泌物和眼分泌物由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大教學(xué)獸醫(yī)院提供，犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)等均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物傳染病學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中注冊的FHV-1 C-27毒株基因登錄號FJ478159.2,選擇gI基因作為靶基因，借助Premier5.0軟件,設(shè)計一對引物。上游引物為gIF：5′-GTCGACATGTCGTCGATAGCCTTC-3′；下游引物為gIR：5′-AAGCTTGGTTTCTTCGTTAATTACGG-3′，將引物序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成。用ddH2O將引物進行稀釋，引物終濃度為10 pmol/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 主要試劑制備 LB(Luria Bertani)液體培養(yǎng)基：稱取10 g Tryptone,5 g Yeast Extract,10 g NaCl，加入到500 mL蒸餾水中，攪拌均勻，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.2之間，將其定容至1 L體積，121℃高壓滅菌25 min，取出后4℃保存。LB(Luria Bertani)固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂，121℃高壓滅菌25 min，待其冷卻至50℃左右，加入10 mg/mL的AMP至終濃度為100 μg/mL將其倒入培養(yǎng)皿中制成平板培養(yǎng)基。待完全凝固后利用封口膜封口，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0×TAE緩沖液：稱取Tris 121 g，EDTA-2Na 18.6 g至400 mL蒸餾水中，充分均勻后加入57.1 mL醋酸并混勻，定容至500 mL體積，常溫保存?zhèn)溆?。使用時用蒸餾水稀釋成1×TAE使用。

1.2.3 提取模板DNA 將疑似病例的眼、鼻分泌物置于含有1 mL 9 g/L鹽水的1.5 mL離心管中，利用DNA快速提取試劑盒按要求進行DNA提取，提取產(chǎn)物，置-20℃冰箱進行保存。

1.2.4 PCR擴增目的片段及產(chǎn)物檢測 制備25 μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL Mix，9.5 μL ddH2O，模板、上下游引物各1 μL。循環(huán)參數(shù)為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55.4℃ 45 s，72℃延伸30 s,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物取出8 μL置10 g/L的瓊脂糖凝膠(20 mL 1×TAE，2 μL核酸染料，0.2 g瓊脂粉。)110 V，電泳30 min，在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413A型)中觀察條帶位置，以DNA Marker DL 2 000為參照進行判讀。將陽性電泳結(jié)果的DNA樣本，置-20℃保存。

1.2.5 陽性樣本gI基因克隆

1.2.5.1 目的片段回收及載體連接 將1.2.4試驗中陽性目的片段進行DNA凝膠回收純化，步驟參照PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒說明書。將純化后的PCR產(chǎn)物與PMD-19T載體進行連接。連接反應(yīng)體系：膠回收產(chǎn)物4 μL，PMD-19T 1 μL，Solution I 5 μL，共計10 μL。將上述各組分混勻后置于16℃水浴4 h后取出放置4℃過夜連接(12 h～15 h)。

1.2.5.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及提取 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希菌感受態(tài)，加入LB液體培養(yǎng)基37℃、200 r/min搖菌1 h，低速離心棄上清液。將剩余部分加入含Amp的LB固體平板培養(yǎng)基上并均勻涂布開，置于37℃溫箱培養(yǎng)14 h。挑取培養(yǎng)基上單個白色菌落接種于3.5 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)14 h。利用重組質(zhì)粒小量提取試劑盒將連接轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進行質(zhì)粒DNA提取。將提取產(chǎn)物作為DNA模板，ddH2O為陰性對照，應(yīng)用已建立的PCR反應(yīng)體系及參數(shù)，進行常規(guī)PCR擴增。對擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。選取陽性質(zhì)粒送北京華大基因科技股份有限公司測序，將測序結(jié)果與已知序列進行比對，從而確定檢測準確性。將陽性質(zhì)粒置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 陽性質(zhì)粒濃度的計算 將1.2.5.2所得陽性重組質(zhì)粒利用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)測定260 nm與280 nm波長下的OD值,判斷其純度，如純度達標按照以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)copies/μL=(6.02×1023)×(質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9)/( 質(zhì)粒的總長度DNA length×660)。

1.2.7 特異性試驗 用已建立的PCR方法，以1.2.5.2中所得陽性重組質(zhì)粒為陽性模板，ddH2O作為陰性對照，分別對犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、羊支原體(M.ovis)、牛支原體(M.bovis)、牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)病毒樣品進行PCR檢測，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察有無目的條帶出現(xiàn)，以檢測PCR方法的特異性。

1.2.8 敏感性試驗 將制備好的陽性質(zhì)粒用ddH2O進行10倍倍比稀釋(101～1011)，將稀釋后的陽性質(zhì)粒分別作為DNA模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，觀察并記錄，確定所建立PCR方法對陽性重組質(zhì)粒最低檢測濃度以檢驗該方法的敏感性。

1.2.9 重復(fù)性試驗 將陽性質(zhì)粒及同一批次的PCR反應(yīng)試劑、引物以及6份陽性DNA樣本(2份為一組)凍存于-20℃，并在1、2、3月后進行復(fù)檢，檢測該方法的穩(wěn)定性。

1.2.10 臨床樣本檢測 對臨床疑似病例的眼鼻分泌物提取總DNA，方法參照1.2.3。利用已建立的PCR檢測方法對送檢的26份(編號L1～L26)眼鼻分泌物進行檢測，匯總和分析檢測結(jié)果。

1.2.11 臨床陽性樣本PCR產(chǎn)物測序 將PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技股份有限公司測序，并對序列與NCBI標準序列進行對比分析，驗證準確性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒gI基因序列測定結(jié)果

對克隆所得陽性質(zhì)粒送至北京華大基因科技股份有限公司測序，測序所得的FHV-1的gI基因序列片段通過DNAStar軟件進行序列拼接。結(jié)果顯示，gI基因全長1 155 bp，包含一個完整的開放閱讀框，編碼384個氨基酸，編碼蛋白分子重量約為43 ku，與預(yù)測結(jié)果一致。對所克隆的陽性質(zhì)粒利用DNAStar 軟件中的Meg Align Clustal W 方法與FHV-1分離株相應(yīng)基因核苷酸進行同源性對比分析。核苷酸同源性比對結(jié)果顯示，1號陽性質(zhì)粒gI基因與FHV-1各分離株相應(yīng)基因核苷酸同源性在99.7%以上(圖1)。

1.本試驗克隆樣本，2～8.FHV-1國際分離株1.Clone sample ,2-8.FHV-1 strains

2.2 陽性質(zhì)?？截悢?shù)計算

根據(jù)公式質(zhì)粒的拷貝數(shù)copies/μL = (6.02×1023)×(質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9)/( 質(zhì)粒的總長度DNA length×660)可對陽性質(zhì)粒進行計算。結(jié)果顯示陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為3.23×1010copies/μL。

2.3 特異性試驗結(jié)果

應(yīng)用已優(yōu)化好的PCR反應(yīng)條件對犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、綿羊肺炎支原體(M.ovis)、牛支原體(M.bovis)、牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)病毒樣品DNA進行PCR檢測。結(jié)果顯示本試驗對犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、綿羊肺炎支原體(M.ovis)、牛支原體(M.bovis)、牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)病毒樣品DNA進行PCR擴增未見目的條帶，證明該方法具有良好的特異性(圖2)。

2.4 敏感性試驗

將1.2.5.2所得陽性質(zhì)粒用ddH2O做10倍倍比稀釋(101～1011)，并作為DNA模板，運用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)程序進行擴增。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并觀察目的條帶情況。根據(jù)2.2質(zhì)粒濃度計算結(jié)果確定質(zhì)粒模板最低檢測量，判斷所建立的PCR方法靈敏性。結(jié)果顯示，在對質(zhì)粒稀釋107倍后可見目的條帶，相應(yīng)DNA模板濃度為3.23×103copies/μL(即最低可檢測136.5 fg/μL的目標DNA)證明該引物敏感性較強可作為診斷引物(圖3)。

2.5 重復(fù)性試驗

將凍存的6份樣陽性樣本分別于1～3月后利用已建立的PCR方法進行復(fù)檢。結(jié)果顯示6個樣本在凍存1～3月后利用已建立的PCR反應(yīng)條件進行擴增均可擴增出1 155 bp目的條帶與2號陽性對照條帶在同一位置(圖4)。

M.DNA 標準DL 2 000 ；1.標準陽性質(zhì)粒；2.陰性對照；3.犬細小病毒；4.犬瘟熱病毒；5.綿羊肺炎支原體；6.牛支原體；7.牛皰疹病毒Ⅰ型

M:DNA Marker DL 2 000；1.Positive control;2.Negative control;3.CPV;4.CDV;5.M.ovis;6.M.bovis;7.BHV-1

圖2 PCR特異性試驗

Fig.2 The spicificity test of the PCR

2.6 臨床初步應(yīng)用

應(yīng)用已建立的PCR診斷方法對送檢的26份臨床疑似病例眼鼻分泌物(編號L1～L26)進行PCR檢測(圖5)。由圖5A可知L1～L3樣本、L5樣本、L10～L12樣本、L14樣本、L15樣本擴增出1 155 bp特異性目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致。判定L1～L3、L5、L10～L12、L14、L15為陽性結(jié)果。由圖 5B可知L17樣本、L19～L23樣本、L25樣本擴增出1 155 bp特異性目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致。判定L17、L19～L23、L25樣本為陽性結(jié)果。

M.DNA 標準DL 2 000；1.陰性對照；2～11.101倍稀釋～1011倍稀釋

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-11.101dilution-1011dilution

圖3 FHV-1常規(guī)PCR敏感性試驗結(jié)果

Fig.3 Sensitivity test results of the conventional PCR of FHV-1

M.DNA 標準DL 2 000 ；1.陰性對照；2.陽性對照；3～4.凍存1個月樣本；5～6.凍存2個月樣本；7～8.凍存3個月樣本

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.Positive control；3-4.Samples cryopreserved for 1 month；5-6.Samples cryopreserved for 2 month；7-8.Samples cryopreserved for 3 month

圖4重復(fù)性試驗結(jié)果

Fig.4 Repetitivity test results

2.7 檢測結(jié)果

將檢測為陽性的PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技股份有限公司測序，并對序列與GenBank標準序列進行對比，結(jié)果表明其同源性皆在99%以上。證實本試驗所測定的陽性結(jié)果為FHV-1感染。

3 討論

貓病毒性鼻氣管炎(FVR)的病原是貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)，是目前已知的危害性較強的貓科動物上呼吸道疾病[1]。該病具有發(fā)病率高死亡率高的特點，幼年貓易感且病死率高，成年貓也可感染但病死率低。但當繼發(fā)及其他疾病感染時也可造成死亡，康復(fù)后成為潛伏感染動物[10]。自1957年美國首次報道FHV-1后世界各地相繼分離出該病毒，2010年我國首次報道從患貓眼、鼻分泌物中分離出FHV-1[11]。由于感染FHV-1的貓在康復(fù)后均可攜帶FHV-1，在免疫能力下降時病毒可再度活化并向外界排毒，這對該病的防治造成了很大困難[12]。目前，獸醫(yī)臨床只能通過較為復(fù)雜繁瑣的實驗室診斷來確診該病。然而PCR診斷方法具有敏感性好、特異性強方便快捷等優(yōu)點。因此，本研究旨在建立適用于臨床檢測的具有特異強、敏感高、方便快捷的PCR診斷方法。本研究根據(jù)GenBank登錄的FHV-1標準序列設(shè)計針對gI引物建立PCR檢測方法。本研究以疑似患貓病毒性鼻氣管炎患貓的眼鼻分泌物總DNA為模板，利用所建立的PCR方法成功擴增出1 155 bp目的條帶，將目的DNA純化后克隆出FHV-1 gI全基因，并制備了標準陽性質(zhì)粒。將陽性質(zhì)粒序列與GenBank登錄的FHV-1各國分離株進行序列比對其同源性在99.7%以上，對所建立的PCR敏感性試驗表明最低檢測DNA模板濃度為3.23×103copies/μL。本試驗與2010年林穎[13]等針對FHV-1 gD基因所建立的PCR診斷方法，以及屈哲[14]等于2011年針對FHV-1 TK基因所建立的PCR診斷方法相比有著更高的敏感性。特異性試驗表明在1 155 bp可出現(xiàn)單一特異性目的條帶證明該方法具有高度靈敏性和特異性可用于臨床樣本檢測。本試驗對26份臨床疑似病例樣本進行檢測，陽性結(jié)果16份，陽性率為61.54%。這一結(jié)果低于2010年劉寶山[15]所報道的86.7%陽性率，也低于2014年王吉[16]所報道的66.7%陽性率。分析原因可能是本試驗所采集病料均來自內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)，對于本病在呼和浩特地區(qū)的流行情況尚無相關(guān)報道，不排除本病在呼和浩特地區(qū)流行率較其他地區(qū)低的可能性。本研究證明可從感染FHV-1的貓眼、鼻分泌物中檢測到FHV-1。對臨床樣本檢測為陽性的PCR產(chǎn)物送至生物公司測序并與GenBank中FHV-1序列進行比對結(jié)果顯示同源性均為99%證實了檢測結(jié)果的準確性。本研究所建立的PCR診斷方法具有特異性強、敏感性高、準確性高等優(yōu)點，適用于臨床樣本的檢測。

M.DNA 標準DL 2 000 ；1.陰性對照；2.陽性對照；A：3～17.L1號樣本～L15號樣本；B：3～13.L16號樣本～L26號樣本M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.Positive control；A：3-17.L1-L15 samples；B： 3-13.L16-L26 samples

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EstablishmentandPreliminaryApplicationofPCRforDetectionofFelidHerpesvirus

LI Hang,LIU Jun-ping,GUAN Ping-yuan,LEI Yu ,LI Zhi

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongolia,010018,China;2.InstituteofHohhotAnimalHealthInspection,Hohhot,InnerMongolia,010020,China)

This study aimed to establish a PCR diagnostic method to feline herpesvirus-1 (FHV-1),which provided a quick test to the clinical specimen.This study designed a pair of specific primers based on the gl genetic sequence of FHV-1,the template used in PCR was the total DNA extracted from occulonasal discharge of cats with suspicious FHV-1 infection.Then,we carried out test to 26 clinical specimen for the specificity,sensitivity,and repeatability.The result showed that the PCR test had no cross reaction with canine parvovirus,cainine distemper virus,Mycoplasmaovis,Mycoplasmabovis.The lowest DNA template test concentration was 3.23×103copies/μL.The positive rate was 61.54%.As a result,this test had high specificity and sensitivity,and can be used to detect clinical infections with FHV-1.

cat; Feline herpesvirus type 1; PCR detection

2017-04-16

李 航(1993-)，男(蒙古族)，吉林梨樹人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)麻醉學(xué)研究。*

S852.659.1

A

1007-5038(2017)11-0086-05