吳浩陽，何亞鵬，付明哲，孫 裴，許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

羊布魯菌陜西分離株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)

吳浩陽1,2，何亞鵬1，付明哲1，孫 裴2*，許信剛1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

對羊布魯菌(Brucella)陜西分離株OMP19基因進(jìn)行克隆、序列分析及原核表達(dá)。 利用GenBank中收錄的布魯菌(KT229642.1)OMP19基因序列，設(shè)計合成引物，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增OMP19基因，并將OMP19基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-OMP19，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE和Western blot法分析。 結(jié)果克隆了羊布魯菌陜西分離株OMP19全基因序列，核苷酸序列分析表明,陜西分離株OMP19基因與國內(nèi)外已報道的羊布魯菌核苷酸同源性超過98%，氨基酸同源性超過98%。OMP19重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)約為19 ku的重組蛋白，該蛋白能與本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存的陽性血清特異性結(jié)合，反應(yīng)原性良好。為羊布魯菌陜西分離株分子生物學(xué)特性研究提供資料，為進(jìn)一步進(jìn)行基因工程疫苗研制及ELISA試劑盒抗體檢測提供了基礎(chǔ)。

布魯菌；OMP19基因；克?。恍蛄蟹治?；原核表達(dá)

布魯菌病是人畜共患病，病原為革蘭陰性的短小桿菌，布魯菌能夠引起懷孕母畜流產(chǎn)，降低母畜的繁殖率，而且還能夠引起慢性感染，諸如人的波浪熱、關(guān)節(jié)炎，公畜的睪丸炎等[1]。布魯菌屬有6個種，20個生物型，其中羊、牛和豬布魯菌能引起大多數(shù)動物和人類疾病，羊布魯菌被認(rèn)為是致病性最強(qiáng)的菌種，人類接觸帶菌動物或食用病畜及其乳制品，均可被感染[2]。在動物中，針對布魯菌感染的免疫通常通過使用布魯菌弱毒平滑菌株如B.abortusS19，B.reutensisRev.1和非平滑菌株B.abortusRB51[3]來對動物進(jìn)行免疫保護(hù)。然而，近年來減毒活疫苗也能夠在免疫妊娠母畜動物中引起流產(chǎn)，引起人類致病，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗生素抗性和誘導(dǎo)動物體內(nèi)產(chǎn)生抗LPS O側(cè)鏈的特異性抗體[4]，進(jìn)而給使用血清學(xué)來區(qū)分自然感染和疫苗感染動物帶來困難。

OMP19主要對布魯菌外膜的結(jié)構(gòu)有影響，它可以作為布魯菌外膜蛋白和多粘菌素之間的橋梁。Tibor A E等[5-7]通過對布魯菌OMP19缺失株的生物特性進(jìn)行研究，表明OMP19基因的缺失改變了布魯菌外膜的結(jié)構(gòu)，并且降低了布魯菌的毒力。國外研究者也證實(shí)了OMP19不僅高度保守且有較高的抗原性，并能夠與自然感染狀態(tài)的羊血清而不與自然感染的牛血清發(fā)生特異性結(jié)合，因此可以作為血清學(xué)診斷、確定布魯菌分型的抗原。本試驗(yàn)成功克隆了布魯菌陜西分離株OMP19基因，并進(jìn)行了序列分析和OMP19基因原核表達(dá)，為進(jìn)一步研制更為有效的疫苗及抗體檢測ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞株 布魯菌陜西分離株(Shanxi)由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態(tài)細(xì)胞Trans5a、BL21為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pET-28a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Blue plus Ⅱ Protein Marker購自天根生化科技有限公司；BamHⅠ，XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購于MBI公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗羊IgG抗體購于CST生物技術(shù)有限公司；2×EsTaqMasterMix、DM2000 plus DNA Marker購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；廣譜蛋白Marker、BacteriaGen DNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 血清 由本實(shí)驗(yàn)室檢測保存布魯菌陽性血清。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 查詢GenBank中收錄的布魯菌OMP19的全基因序列(KT229642.1)，利用Primer 5.0 設(shè)計OMP19的特異性引物(OMP19F/OMP19R)，上游引物5′- GGATCCATGCCAATAACAAAAGCAAG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物5′- CTCGAGTCATTGCGACCGCGTCAC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增長度為534 bp片段，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA提取 布魯菌DNA用天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。

1.2.3 OMP19基因擴(kuò)增 以提取的布魯菌基因組DNA為模板，50 μL PCR反應(yīng)體系：2×ESTaqMastermix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板5 μL，ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。膠回收OMP19目的片段，連接至pEASY-T1載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)并PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒并命名為pEASY-T1-OMP19。

1.2.4 原核表達(dá)載體pET-OMP19的構(gòu)建 同時用BamHⅠ和XhoⅠ分別雙酶切pEASY-T1-OMP19及pET-28a空質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收酶切目的片段產(chǎn)物。將膠回收的OMP19目的片段與膠回收的pET-28a質(zhì)粒的目的片段用T4連接酶于16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落分別進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定后，提取陽性質(zhì)粒送金斯瑞(南京)測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-OMP19。

1.2.5 OMP19的基因序列分析及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用NCBI BLAST功能將OMP19測序結(jié)果與GenBank已收錄的布魯菌基因組DNA(JQ865996.1、KP101384.1、KT229642.1、L27997.1)序列進(jìn)行比對。利用Internet在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測OMP19編碼蛋白的信號肽和跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)。利用DNA Star軟件預(yù)測分析蛋白的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性。

1.2.6 重組OMP19蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 將測序鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET-OMP19和pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，按1% 轉(zhuǎn)接6 mL新鮮LB培養(yǎng)基后，培養(yǎng)至對數(shù)期(約3 h～3.5 h)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)5 h后，收集1.5 mL菌液的菌體，100 μL PBS洗滌1次后用100 μL PBS重懸，超聲裂解30 min。加入20 μL 6×Loading buffer混勻，煮沸8 min，10 000 r/min離心10 min，取15 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE。其他條件不變，摸索不同IPTG終濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)時間(3 h～6 h)對重組蛋白表達(dá)的影響，重組蛋白表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.7 重組蛋白OMP19表達(dá)形式分析 在1.2.6的優(yōu)化誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)OMP19蛋白，分別取菌液上清，超聲菌體裂解上清和菌體裂解沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白表達(dá)形式。

1.2.8 OMP19蛋白的Western blot分析 將OMP19表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE后，150 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h,置于50 g/L脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h后，以1∶500倍稀釋的布魯菌陽性血清4℃孵育過夜。洗脫液振蕩洗膜，每次10 min共洗滌3次。加入1∶10 000倍稀釋的HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的鼠抗羊IgG抗體,室溫孵育1 h，振蕩洗膜，每次10 min共洗滌3次。最后顯色反應(yīng)液孵育PVDF膜，暗室壓片曝光。同時設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的布魯菌基因組DNA為模板，根據(jù)設(shè)計的引物擴(kuò)增到了534 bp的OMP19基因片段，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.OMP19擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Amplified products of OMP19

圖1 OMP19基因的擴(kuò)增

Fig.1 Amplification of OMP19 gene by PCR

2.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET-OMP19經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)534 bp的目的條帶和5 369 bp的載體條帶，目的條帶與PCR鑒定一致，表明重組pET-OMP19質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.pET-OMP19經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切；2.OMP19 PCR鑒定

M.DNA Marker DL 2 000；1.pET-OMP19 digested withBamHⅠandXhoⅠ；2.Identification of pET-OMP19 by PCR

圖2重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.3 OMP19序列分析及進(jìn)化樹分析

NCBI BLAST后發(fā)現(xiàn)，OMP19測序結(jié)果與GenBank已收錄的布魯菌基因組DNA序列(JQ865996.1、KP101384.1、KT229642.1、L27997.1)OMP19基因相似性在98%以上，證明了布魯菌的OMP19基因較為保守。利用Internet在線軟件預(yù)測OMP19氨基酸序列，結(jié)果表明該氨基酸序列沒有信號肽(圖3)和跨膜區(qū)(圖4)。用DNA Star分析OMP19多肽氨基酸序列的抗原指數(shù)、親水性和表面分布可能性，結(jié)果如圖5，并且進(jìn)行了核苷酸遺傳進(jìn)化分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，結(jié)果顯示布魯菌陜西分離株OMP19基因與KP101384.1、KT229642.1位于一個小分支，表明親緣關(guān)系最近。

圖3 信號肽預(yù)測

圖4 跨膜區(qū)預(yù)測

圖5 OMP19蛋白序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性分析

2.4 重組蛋白OMP19誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

其他條件不變,以IPTG濃度為1 mmol/L為定量，在不同誘導(dǎo)時間(3、4、5、6 h)下，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)6 h后，重組蛋白OMP19表達(dá)量顯著增加(圖7),使用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示IPTG濃度對重組蛋白OMP19表達(dá)量影響不大(圖8)。

2.5 重組蛋白表達(dá)形式的分析

在上述最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下，分別取菌液上清、超聲裂解菌體上清和超聲裂解菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示重組OMP19蛋白主要存在于沉淀中，表明該蛋白主要以包涵體形式存在(圖9)。

2.6 重組OMP19蛋白Western blot分析

Western blot結(jié)果顯示，OMP19重組蛋白能與羊布魯菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)并且出現(xiàn)特異性條帶，而陰性對照重組菌不與陽性血清發(fā)生反應(yīng)(圖10)。

圖6 OMP19核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1.未誘導(dǎo)pET-OMP19 ；2～5.分別誘導(dǎo)3，4，5，6 h的pET-OMP19

M.Protein molecular weight Marker ；1.Uninduced cells containing pET-OMP19；2-5.Cells containing pET-OMP19 induced for 3,4,5 and 6 h，respectively

圖7不同誘導(dǎo)時間對重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.7 Effects of different induction time on expressions of OMP19 fusion protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1～5.分別用終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pET-OMP19

M.Protein molecular weight Marker；1-5.Cells containing pET-OMP19 induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG，respectively

圖8 IPTG不同濃度對重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

Fig.8 Effects of different IPTG concebtrations on expressions of OMP19 fusion protein

3 討論

布魯菌病不但具有分布范圍特別廣、強(qiáng)烈傳染性、嚴(yán)重危害的特點(diǎn)，而且嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對布魯菌病的診斷、防控、凈化和疫苗研究一直在世界范圍內(nèi)受到重視。不同種間的布魯菌基因型具有高度的同源性，但毒力、生物學(xué)特性、臨床癥狀及流行特征等卻存在著各樣差異，這即給布魯菌病診斷和疫苗的研究提供了有利條件但同時也帶來了很大的限制，在整個世界范圍內(nèi)目前還沒有一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的檢測方法，而且現(xiàn)有疫苗不能夠達(dá)到預(yù)防的效果。因此，有必要繼續(xù)對布魯菌病檢測方法和疫苗的研制進(jìn)行深入和創(chuàng)新性的探討與研究。布魯菌的外膜蛋白(OMPs)，即是結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，也是重要的抗原和毒力因子[8]，對維持布魯菌細(xì)胞膜的完整性至關(guān)重要[9]。Simborio H L等[10]的報道，表明在牛布魯菌抗體的ELISA檢測方面多種OMP抗原混合可能更優(yōu)于單一OMP抗原。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.菌液上清；2.菌體裂解沉淀；3.菌體裂解上清

M.Protein molecular weight Marker；1.Supernatant of lysogeny broth；2.Soluble lysates；3.Insoluble lysates

圖9 OMP19重組蛋白表達(dá)形式分析

Fig.9 Expression forms of OMP19 fusion protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a對照菌; 2.OMP19重組蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET-28a control; 2.OMP19 fusion protein

圖10 OMP19重組蛋白的Western blot結(jié)果

Fig.10 Western blot analysis of OMP19 fusion protein

本研究成功的克隆布魯菌陜西分離株OMP19的全長基因并原核表達(dá)了OMP19蛋白。本研究與王娜等[11]建立的布魯菌OMP19原核表達(dá)重組蛋白的大小一致，均為19 ku，而且還與NCBI上登錄的其他布魯菌毒株的OMP19基因進(jìn)行核苷酸序列比對分析，結(jié)果顯示，該分離株與其他毒株的核苷酸序列相似性超過98%，其中與NCBI收錄布魯菌序列號KT229642.1分離株毒株同源性最高，核苷酸同源達(dá)100%，表明布魯菌的OMP19基因較為保守。利用在線生物軟件預(yù)測布魯菌OMP19蛋白序列，分析OMP19蛋白沒有信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域。本試驗(yàn)在大腸埃希菌中表達(dá)了陜西分離布魯菌株OMP19蛋白，為診斷布魯菌的研究、研制基因工程疫苗以及抗布魯菌OMP19單克隆抗體的制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Cloning,SequenceAnalysisandProkaryoticExpressionofOMP19GeneofGoatBrucellainShaanxiProvince

WU Hao-yang1,2,HE Ya-peng1,FU Ming-zhe1,SUN Pei2,XU Xin-gang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui,230036,China)

Cloning,sequence analysis and prokaryotic expression of OMP19 gene ofBrucellaShaanxi isolate were carried out.OMP19 gene was amplified by PCR using the OMP19 gene sequence ofBrucella(KT229642.1) in GenBank.The OMP19 gene was ligated into the prokaryotic expression vector pET-28a and the recombinant plasmid was successfully constructed.PET28a-OMP19 was transformed into BL21 competent cells to induce expression.SDS-PAGE and Western blot analysis were used for detecting the expression.The OMP19 gene of Shaanxi isolate was successfully cloned.The nucleotide sequence of OMP19 gene of Shaanxi isolate was found to be over 98% similarity to that reported in China and abroad.The amino acid similarity was more than 98%.OMP19 recombinant protein was induced to express about 19 ku recombinant protein,the protein can be identified with positive serum,showing good specificity and reactivity.This study provided the data for the study on the molecular biological characteristics ofBrucellaisolates in Shaanxi province,and provided the basis for further genetic engineering vaccine development and antibody detection by ELISA kits.

Brucella; OMP19 gene; cloning; sequence analysis; prokaryotic expression

2017-01-14

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-092)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項(xiàng)目(2016KTZDNY02-05)；楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)科技示范推廣項(xiàng)目(TS-2016-13；2017-TS-23)

吳浩陽(1991-)，男，河南洛陽人，碩士，主要從事動物傳染病診斷與防治研究。*

S852.614

A

1007-5038(2017)11-0028-05