宋 騰 ，張燕萍 *

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

米渣蛋白質(zhì)脫糖去雜工藝研究

宋 騰1，2，張燕萍*1，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

為獲得米渣脫糖去雜的最佳方法，分析了凍融預(yù)處理、酶處理、超聲波及其協(xié)同作用對(duì)米渣蛋白純度的影響，然后對(duì)液固體積質(zhì)量比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和超聲波功率等因素對(duì)米渣蛋白純度的影響進(jìn)行研究，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Central Composite中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以米渣蛋白純度為響應(yīng)值，建立米渣脫糖去雜的二次回歸模型，通過(guò)響應(yīng)面分析和方差分析得出影響米渣脫糖效果的最優(yōu)參數(shù)為：液固體積質(zhì)量比6.1 mL/g、加酶量600 μ/g、酶解溫度62℃、酶解時(shí)間88 min、超聲波功率140 W，此時(shí)所得米渣蛋白質(zhì)的純度為92.01%，與理論預(yù)測(cè)值（92.68%）一致。

凍融；超聲波；糖化酶；米渣；工藝優(yōu)化

米渣是淀粉糖、味精、飴糖等大米深加工后的副產(chǎn)物[1]，在淀粉糖生產(chǎn)和味精發(fā)酵工業(yè)每年產(chǎn)生3 000多萬(wàn)噸[2]，多用于動(dòng)物飼料，利用率較低。而米渣中含有大量的蛋白質(zhì) （質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～70%）[3-4]，幾乎保留了大米中所有的蛋白質(zhì)，明顯高于大豆蛋白含量；并且相對(duì)于其它植物蛋白，大米蛋白的蛋白價(jià)、消化率及省物價(jià)等方面均具有較高的優(yōu)勢(shì)，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源。在大米糖化加工過(guò)程中，高熱和高壓作用致使大米中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性并且經(jīng)美拉德途徑與糖形成糖蛋白復(fù)合物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取難、溶解性和乳化性較差[5-6]。因此，有必要建立一種高效的提取方法，既能提高米渣中蛋白質(zhì)的回收率，又能改善其功能性如溶解性和乳化性，從而提高米渣蛋白的生物利用率。

目前，米渣中提取蛋白質(zhì)的方法主要有：堿溶酸沉法[6]、酶水解法[7]、堿酶法[3]、超聲預(yù)處理[6]等，但是堿法和酸法提取分別需要較高濃度的堿液和酸液，致使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到很大的破壞，容易產(chǎn)生不良風(fēng)味和危害健康的物質(zhì)；此外，米渣中的蛋白被外層的糊精、淀粉緊密包裹，形成致密的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶解效率較低。

作者首先利用凍融對(duì)米渣進(jìn)行預(yù)處理，使大米蛋白和淀粉、糊精形成的致密高分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為疏松，同時(shí)結(jié)合超聲波處理斷裂米渣中的化學(xué)鍵，從而增加酶與反應(yīng)底物位點(diǎn)接觸的概率，促進(jìn)更多的淀粉降解為可溶性糖，從而提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣：上海某大米深加工公司提供；糖化酶（酶活50 000 u/g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-300DV數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品；RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機(jī)：無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；EL3002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 米渣→粉碎→過(guò)100目篩→脫脂→堿液溶解→-20℃冷凍→研磨粉碎（冷凍、研磨循環(huán)重復(fù)2次）→調(diào)節(jié)pH→糖化酶→超聲波→超聲波協(xié)同水浴酶解→滅酶→離心分離→水洗→冷凍干燥

1.3.2 測(cè)定方法 按照GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)，蛋白質(zhì)系數(shù)為5.95。

蛋白質(zhì)純度 （%）=（樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 比較不同處理方式（Ⅰ（對(duì)照，未處理米渣）、Ⅱ糖化酶、Ⅲ凍融+糖化酶、Ⅳ超聲波預(yù)處理+糖化酶、Ⅴ超聲波協(xié)同糖化酶、Ⅵ凍融+超聲波協(xié)同糖化酶）對(duì)米渣蛋白去雜效果的影響。

單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要考慮料比、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間及超聲波功率等因素對(duì)米渣蛋白純度的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Central Composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以蛋白質(zhì)純度為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)米渣蛋白脫糖去雜工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)脫糖工藝條件。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。中心組合實(shí)驗(yàn)的因素水平如表1所示。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對(duì)米渣蛋白脫糖效果的比較

由圖1可以看出，不論是單獨(dú)糖化酶水解或超聲波協(xié)同糖化酶水解，凍融處理均有助于糖化酶對(duì)淀粉的水解，從而提高米渣蛋白的純度?？赡茉蛟谟谠诿自膬鋈谶^(guò)程中，水分進(jìn)入淀粉分子內(nèi)部，由此在米渣顆粒內(nèi)外形成的冰晶在循環(huán)冷凍過(guò)程中對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)造成損傷[8]，并且隨著凍融次數(shù)的增加，冰晶的形成和溶解產(chǎn)生一定的機(jī)械力，擴(kuò)大了淀粉分子內(nèi)部通道，使得淀粉包括的蛋白質(zhì)釋放出來(lái)[8-9]，而且增加了糖化酶與淀粉接觸的概率，加速了淀粉降解效率。此外，與超聲波預(yù)處理相比，超聲波與酶解協(xié)同處理對(duì)米渣蛋白的純度影響較大，其原因在于[10-13]：超聲波在介質(zhì)中形成的微流效應(yīng)促進(jìn)底物迅速進(jìn)入酶的催化部位及產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)，表構(gòu)象發(fā)生改變，使其折疊更合理，易于與底物結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)進(jìn)程，提高酶催化效率。

圖1 不同處理方式對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.1 Effect of different treatment on the purity of rice protein isolates

2.2 液固體積質(zhì)量比對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響

由圖2可知，隨著液固體積質(zhì)量比的增加，米渣蛋白的純度不斷增加；當(dāng)液固體積質(zhì)量比達(dá)到6 mg/L時(shí)，米渣蛋白的純度達(dá)到最大值，此后隨著液固比的增加，米渣蛋白的純度出現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)，說(shuō)明反應(yīng)體系中過(guò)量的液體會(huì)阻礙酶對(duì)淀粉的降解。原因在于超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，在介質(zhì)中的不同部位所形成的超聲場(chǎng)強(qiáng)度；當(dāng)液固體積質(zhì)量比達(dá)到一定值時(shí)，適當(dāng)強(qiáng)度的超聲波進(jìn)入米渣顆粒內(nèi)部，使米渣顆粒結(jié)構(gòu)變的較為疏松并且破壞淀粉中的部分化學(xué)鍵[13-14]，相應(yīng)促進(jìn)了酶反應(yīng)；但是隨著體系中液體介質(zhì)的增加，超聲場(chǎng)強(qiáng)度被稀釋?zhuān)?/p>

酶解效率下降，表現(xiàn)出液固體積質(zhì)量比超過(guò)一定值時(shí)，米渣蛋白質(zhì)的純度開(kāi)始下降。

圖2 液固體積質(zhì)量比對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the purity of riceprotein isolates

2.3 加酶量對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響

由圖3可知，隨著加酶量的增加，米渣蛋白質(zhì)的純度不斷上升，當(dāng)加酶量大于500 u/g時(shí)，米渣蛋白的純度幾乎不再增加。原因在于在反應(yīng)底物一定的情況下，加酶量不足時(shí)，其全部參與酶催化反應(yīng)，隨著加酶量的增加，可利用底物與酶充分接觸完全反應(yīng)，繼續(xù)增加酶的使用量并不會(huì)使不可利用底物參與反應(yīng)，因而當(dāng)加酶量超過(guò)500 u/g時(shí)，幾乎沒(méi)有額外的淀粉被降解。

圖3 加酶量對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on the purity of rice protein isolates

2.4 酶解溫度對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度影響

由圖4可以看出，酶解溫度對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響較為明顯，隨著酶解溫度的上升，米渣蛋白質(zhì)的純度不斷上升；當(dāng)酶解溫度達(dá)到60℃時(shí)，米渣蛋白質(zhì)純度達(dá)到最大值；當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，米渣蛋白質(zhì)純度出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。原因在于當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，糖化酶的活性下降，對(duì)淀粉的水解效率降低；此外，隨著溫度的升高，米渣中未被水解的淀粉易發(fā)生糊化[15-16]，從而造成反應(yīng)體系粘度的上升，阻礙了料液的流動(dòng)，降低了酶與淀粉的接觸機(jī)率，間接抑制了酶對(duì)淀粉的降解。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響

由圖5可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，米渣蛋白質(zhì)的純度不斷上升，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到80 min時(shí)，米渣蛋白質(zhì)純度達(dá)到最大值，其后米渣蛋白質(zhì)的純度略微下降。原因在酶解的開(kāi)始階段，酶將體系中的淀粉降解轉(zhuǎn)化為可溶性的糊精和其它糖類(lèi)物質(zhì)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其對(duì)淀粉的降解效果越好，并且酶解時(shí)間的延長(zhǎng)有利于將米渣中的淀粉結(jié)構(gòu)變得更為疏松[17]，增加了酶活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合，酶解效果也就越好；但是當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)一定值時(shí)，酶解產(chǎn)生的可溶性糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入米渣的空隙中，并且部分和米渣中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)[18]，重新結(jié)合在蛋白質(zhì)上，相應(yīng)降低了米渣蛋白質(zhì)的純度。

圖4 酶解溫度對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the purity of rice protein isolates

圖5 酶解時(shí)間對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the purity of rice protein isolates

2.6 超聲波功率對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響

由圖6可以看出，在100～140 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增加，米渣蛋白質(zhì)純度逐漸提高，在140 W時(shí)達(dá)到最大值；但是當(dāng)超聲波功率大于140 W時(shí)，米渣蛋白質(zhì)純度隨著超聲波功率的增加而逐漸下降。原因在于在一定范圍內(nèi)（100～140 W），隨著功率的增加，超聲波的空化和機(jī)械剪切作用逐漸增強(qiáng)，淀粉形成的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)也就越多[10]，米渣結(jié)構(gòu)變得越疏松，增加了酶與底物的結(jié)束，加速了酶催化淀粉降解；超聲波在米渣溶液體系中傳播時(shí)，產(chǎn)生的微流效應(yīng)促進(jìn)淀粉與酶的催化部位充分結(jié)合以及降解產(chǎn)生的可溶性物質(zhì)進(jìn)入介質(zhì)[13]，表現(xiàn)為超聲波促進(jìn)米渣中淀粉的降解速率的提高；空化作用產(chǎn)生的沖擊波改變了酶分子的構(gòu)象[12]，使其折疊更合理，更易于與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物，從而影響酶促反應(yīng)的進(jìn)程，提高了酶催化效率。但是隨著超聲功率的增加，水分子降解產(chǎn)生的自由基能促使酶分子中二硫鍵的斷裂以及促使硫原子產(chǎn)生R-SH，破壞了酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)；同時(shí)超聲波功率的增強(qiáng)，由此產(chǎn)生的空化作用也逐漸增強(qiáng)，破壞了酶的分子結(jié)構(gòu)甚至是斷裂酶分子成小片段，使酶活性下降，降低了酶對(duì)米渣中淀粉的降解，表現(xiàn)為米渣蛋白質(zhì)純度的下降。

圖6 超聲功率對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響Fig.6 Effect of ultrasound power on the purity of rice protein isolates

2.7 米渣蛋白質(zhì)的超聲波輔助酶法脫糖去雜工藝優(yōu)化及方差分析

通過(guò)Design Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得出如下回歸模型：

同時(shí)得到模型的方差分析結(jié)果，如表2所示。方差分析結(jié)果可以得出，所建立的模型在α=0.01水平上極顯著的，液固比、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)米渣蛋白純度的影響在α=0.001水平上極顯著。對(duì)于二次項(xiàng)來(lái)說(shuō)，AB、AC、BC在α=0.01水平極顯著，CD、CE在α=0.05水平上顯著，說(shuō)明這些因素直接存在相互作用。對(duì)于模型的Lack of Fit，其P值=0.066 2，不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)誤差較小；并且模型的R2=0.974 9、R2Adj=0.955 0，說(shuō)明模型的擬合效果較好，能對(duì)用于描述實(shí)驗(yàn)所考察各因素對(duì)米渣蛋白純度的影響。

2.8 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)方差分析結(jié)果，采用Design Expert對(duì)存在相互交互影響的因素進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，結(jié)果顯示：液固體積質(zhì)量比和加酶量對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響之間存在顯著的交互作用。同時(shí)，加酶量對(duì)米渣純度的影響大于溫度對(duì)米渣蛋白純度的影響、酶解時(shí)間對(duì)米渣蛋白純度的影響大于酶解溫度米渣蛋白的影響，酶解溫度對(duì)米渣蛋白純度的影響大于超聲波功率對(duì)米渣蛋白純度的影響。

3 結(jié)語(yǔ)

1）比較分析了糖化酶、凍融+糖化酶、超聲波預(yù)處理+糖化酶、超聲波協(xié)同糖化酶、凍融+超聲波協(xié)同糖化酶等處理對(duì)米渣蛋白的脫糖效果，得出凍融、超聲波協(xié)同有利于米渣中淀粉降解，促進(jìn)了糖化酶對(duì)米渣的脫糖效果。

2）各因素對(duì)米渣蛋白純度的影響順序?yàn)椋阂汗腆w積質(zhì)量比＞加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度＞超聲波功率，并且得到脫糖的最優(yōu)參數(shù)為：液固體積質(zhì)量比 6.1 mL/g、加酶量 600 u/g、酶解溫度62℃、酶解時(shí)間88 min、超聲波功率140 W，此時(shí)所得米渣蛋白的純度為92.01%。

3）通過(guò)不同處理方式比較以及單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得出凍融預(yù)處理結(jié)合超聲波協(xié)同酶處理能夠有效對(duì)米渣中的淀粉進(jìn)行降解，提高米渣蛋白的純度。

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The Purity of Rice Protein Isolates Subjected

SONG TENG1，2，ZHANG Yanping*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to obtain the optimum Impurity removal technologies of rice protein isolates，this paper analysis freeze-thawing pretreatment，enzymatic hydrolysis on，ultrasound，and their synergy on the purity of rice protein isolates.Then the effects of liquid-solid ratio，enzyme concentration，enzymolysis time，enzymolysis temperature and ultrasound power on the purity of rice protein isolates were analyzed.On the basis of single factor experiments，Central Composite design combined with response surface analysis and variance analysis were employed to optimize process parameters.The optimum process conditions were as follows：liquid-solid ratio 6.1 mL/g，enzyme concentration 600 u/g，enzymolysis temperature 62 ℃ ，enzymolysis time 88min and ultrasound power 140 W.Under these conditions，the theoretical purity of rice protein isolates was 92.68% ，which was closely agreed with the experimental value（92.01%）.

freeze-thawing，ultrasound，glucoamylase，rice dreg，process optimization

TS 262.4

A

1673—1689（2017）10—1106—05

2015-09-02

*通信作者：張燕萍（1964—），女，江西南昌人，副教授，主要從事谷物與淀粉工程研究。E-mail：1170676297@qq.com

宋騰，張燕萍.米渣蛋白質(zhì)脫糖去雜工藝研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（10）：1106-1110.