劉佳妮　胡昳　尹利方　張瑜瑜　徐勝光　張永?！￡悵杀蟆∮嗬?/p>

摘要：為探討馬鈴薯對馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）取食的防御反應(yīng)分子機(jī)制，在室內(nèi)條件下測定馬鈴薯塊莖蛾取食、機(jī)械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)處理后馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過氧化物酶（POD）基因（pod）和過氧化氫酶（CAT）基因（cat）的相對表達(dá)量，同時以健康植株為對照。結(jié)果表明：pal、pod和cat基因表達(dá)量變化趨勢存在差異，說明馬鈴薯塊莖蛾取食既激活了水楊酸介導(dǎo)的防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也激活了茉莉酸介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且2個通路間存在交互作用。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯塊莖蛾；取食；防御酶；基因表達(dá)

中圖分類號： S4334文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0112-03

收稿日期：2016-05-30

基金項目：云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（編號：2012FD044）。

作者簡介：劉佳妮（1983—），女，云南昆明人，博士，副教授，主要從事昆蟲生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：ljn0131@163com。

通信作者：余磊，博士，教授，主要從事分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。E-mail：47067521@qqcom。

植物與植食性昆蟲長期的相互作用形成了多種防御機(jī)制。在植物對昆蟲的化學(xué)防御體系中，除了利用體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行直接防御外，其間接防御也起著相當(dāng)重要的作用。植物體在受到害蟲取食危害后，會釋放包括茉莉酸（jasmonic acid，簡稱JA）、水楊酸（salicylic acid，簡稱SA）和乙烯（ethene，簡稱ET）等揮發(fā)性氣體的信號物質(zhì)。研究表明，JA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是蟲害和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的主要途徑，對植物抵御咀嚼式昆蟲危害非常重要，咀嚼式昆蟲咬食植物，其唾液分泌物能夠在取食位點直接產(chǎn)生幾丁質(zhì)或多聚糖，作為信號途徑的誘導(dǎo)因子。而這一系列變化同樣能夠被水楊酸甲酯（methyl salicylic，簡稱MeSA）誘導(dǎo)產(chǎn)生。MeSA、JA作為與植物損傷相關(guān)的信號分子，共同參與植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)，一方面可以減弱防御反應(yīng)中活性氧等對細(xì)胞的損傷，另一方面可以增強(qiáng)協(xié)同抗性1]。Berenbaum的研究也發(fā)現(xiàn)，JA處理的植物與對照相比造成的昆蟲死亡率大大提高，害蟲危害程度減輕，植物對害蟲脅迫的抗性增強(qiáng)2-3]。

馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaea operculella （Zeller）]別稱煙草潛葉蛾、馬鈴薯麥蛾，隸屬鱗翅目（Lepidoptera）雙孔亞目（Ditrysia）麥蛾總科（Gelechioidea）麥蛾科（Gelechiidae）。該蟲最早記載于1854年，在澳大利亞發(fā)現(xiàn)該蟲危害煙草；國內(nèi)對馬鈴薯塊莖蛾的記載最早始于1937年，陳金壁報道該害蟲在廣西柳州危害煙草，現(xiàn)已廣泛分布于云南、貴州、廣西、湖南、湖北及臺灣地區(qū)等，且發(fā)生較為普遍，是一種重要的國際國內(nèi)檢疫性害蟲。該蟲寄主種類很多，主要危害茄科植物，其中以馬鈴薯、煙草、茄子等受害最重4]。目前對于馬鈴薯塊莖蛾的報道不多，并且還只是一些關(guān)于其發(fā)生規(guī)律、生理生殖和化學(xué)防治等層面的初步研究，還沒有更深層次的關(guān)于其生化及分子生物學(xué)等方面的相關(guān)研究。云南省地處西南山區(qū)，是國內(nèi)馬鈴薯和煙草主要的種植產(chǎn)區(qū)，隨著種植業(yè)的發(fā)展，馬鈴薯連作面積逐年增加，加上云南省近年來受全球氣候的影響，持續(xù)干旱的天氣也為該蟲的生存繁殖提供了適宜的氣候條件，使其病蟲危害逐年加重。本研究探討馬鈴薯塊莖蛾取食馬鈴薯后，植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過氧化物酶（POD）基因（pod）和過氧化氫酶（CAT）基因（cat）3種防御酶基因表達(dá)的變化，并與外源信號物質(zhì)誘導(dǎo)的變化作對比，以期探討馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)激活的防御酶基因表達(dá)的動態(tài)變化，為進(jìn)一步探究馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)馬鈴薯防御反應(yīng)的機(jī)制和為害蟲治理、抗蟲植物的培育提供新的思路，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供必要的理論保障。

1材料與方法

11供試?yán)ハx和供試植物

馬鈴薯塊莖蛾：馬鈴薯塊莖蛾飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室內(nèi)，溫度控制在（27±2） ℃，相對濕度為80%～90%。在散射光照儲藏條件下的馬鈴薯塊莖上進(jìn)行飼養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h5]。

馬鈴薯植株：供試馬鈴薯植株均同期栽種于花盆中，并置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，待馬鈴薯幼苗生長至4葉期時用于試驗。

12植株處理

設(shè)置4種處理：（1）馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)（Phthorimaea operculella feeding，簡稱POF）：每株馬鈴薯幼苗接種5頭馬鈴薯塊莖蛾成蟲（羽化后3 d未交配成蟲，接種前饑餓處理 12 h）放入防蟲網(wǎng)內(nèi)，取食24 h后取出成蟲。（2）機(jī)械損傷處理（mechanical acid，簡稱MD）：用已消毒的注射器針頭（Φ=1 mm）在健康的馬鈴薯葉背面刺40次。以同期健康未受危害的馬鈴薯幼苗為對照（CK）。（3）外源茉莉酸誘導(dǎo)：以 01 mmolL 外源茉莉酸葉面噴施馬鈴薯葉片。（4）外源水楊酸甲酯誘導(dǎo)，以05 mmolL外源水楊酸甲酯葉面噴施馬鈴薯葉片。

每種處理盆栽馬鈴薯均分別置于不同的封閉玻璃容器中，分別在24、48、72、96 h取樣。以健康、未受傷的馬鈴薯植株作為對照（CK），取樣時間同上。取樣后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)使用1株馬鈴薯植株，本試驗中所有的馬鈴薯植株都保持相同的生理狀態(tài)。

13總RNA提取

馬鈴薯葉片總RNA的提取采用TRIzol試劑（Invitrogen），按照操作說明進(jìn)行提取。本試驗中各處理和對照的葉片總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外-可見分光光度計檢測RNA的純度與濃度。

14cDNA 合成endprint

按照RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）的操作方法，將以上各處理時間點的馬鈴薯葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或于-80 ℃貯藏備用。

15防御基因熒光定量PCR

實時熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系，按照iTaqUniversal SYBR GreenSupermix 試劑盒說明進(jìn)行操作。各反應(yīng)成分的含量為100 μL iTaqUniversal SYBR GreenSupermix（2×），各05 μL正向、反向引物，1 μL合成的cDNA模板，加水至20 μL，混勻、微離心后放入PCR儀內(nèi)擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)。反應(yīng)中設(shè)置空白對照，分別使用DNA和水為模板，每個樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線。熒光定量引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用相對定量法檢測不同處理條件下基因表達(dá)量的差異。

16數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析利用SPSS 180軟件。方差分析采用LSD多重比較法檢驗處理間的差異顯著性（α=005）。

2結(jié)果與分析

21不同處理對馬鈴薯過氧化氫酶基因cat相對表達(dá)量的影響

由圖1可見，與健康植株相比，4種處理下馬鈴薯葉片中cat基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后，cat的表達(dá)量顯著升高，96 h后基本恢復(fù)至對照水平；機(jī)械損傷處理后，cat表達(dá)量在24～96 h幾乎與對照水平相當(dāng)，沒有顯著變化；外源茉莉酸處理后，cat基因表達(dá)量先顯著低于對照水平，然后逐漸升高，僅在96 h時高于對照水平；外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達(dá)量的變化與馬鈴薯塊莖蛾取食基本相似。

FK（W11]TPLJN1tif]

22不同處理對馬鈴薯過氧化物酶基因pod相對表達(dá)量的影響

由圖2可知，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后，pod的表達(dá)量略有升高，48 h后達(dá)到最大值，72 h后比對照稍低，96 h后基本恢復(fù)至24 h的水平；機(jī)械損傷處理后，pod表達(dá)量在24～96 h始終高于對照水平，48 h后達(dá)到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再降低再升高的趨勢，在96 h達(dá)最大值；外源水楊酸甲酯處理后，pod基因表達(dá)量變化與馬鈴薯塊莖蛾取食的基本相似。

FK（W11]TPLJN2tif]

23不同處理對馬鈴薯苯丙氨酸解氨酶基因pal相對表達(dá)量的影響

由圖3可見，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后pal的表達(dá)量顯著升高，隨后呈現(xiàn)出降低—升高的變化趨勢；機(jī)械損傷處理后，pal的表達(dá)量在24 h后升高，隨后一直降低，96 h時顯著低于對照水平；外源茉莉酸處理后，pal基因的表達(dá)量與對照相比變化不大；外源水楊酸甲酯處理后，48 h后pal基因表達(dá)量略有升高，96 h時達(dá)到最大值。

3討論

在自然系統(tǒng)中，植食性昆蟲取食誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，而植食性昆蟲通過改變自身來適應(yīng)植物的變化，兩者始終處于一種平衡狀態(tài)。之前的研究表明，PAL、POD、CAT 3種保護(hù)酶與植物的抗蟲能力密切相關(guān)。本研究通過馬鈴薯塊莖蛾取

FK（W11]TPLJN3tif]

食、機(jī)械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)處理后分析馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶基因（pal）、過氧化物酶基因（pod）和過氧化氫酶基因（cat）的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，馬鈴薯葉片中3種酶基因在不同誘導(dǎo)條件和時間下的相對表達(dá)量均發(fā)生不同的變化。

過氧化氫酶是植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動物的肝和紅細(xì)胞中，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。前人的研究發(fā)現(xiàn)，cat的表達(dá)量不僅與植物的發(fā)育時期、組織和器官有關(guān)，還與環(huán)境有很大關(guān)系6]。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源茉莉酸誘導(dǎo)后，馬鈴薯中cat的表達(dá)量先升高后基本恢復(fù)至對照水平，外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達(dá)量在96 h時高于對照水平。外源信號物質(zhì)水楊酸甲酯誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中cat的表達(dá)量。毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，cat基因表達(dá)量僅在48 h時均低于對照水平，且變化較酶活性變化明顯7]，這可能與CAT活性由多種cat基因調(diào)控有關(guān)。

過氧化物酶是植物保護(hù)酶系的重要保護(hù)酶之一8]，它可以與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶相互協(xié)調(diào)配合，清除過剩的自由基，使體內(nèi)自由基維持在正常的動態(tài)水平，以提高植物的抗逆性。曾淑華等在對煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，傷害處理能使過氧化物酶基因pod的轉(zhuǎn)錄水平迅速提高，但是對SA卻無明顯反應(yīng)，而MeJA則抑制其表達(dá)9]。在棉花中已經(jīng)報道了12個編碼第三類過氧化物酶的基因。pod基因表達(dá)結(jié)果與POD活性測定結(jié)果相比可知，它們的變化趨勢恰好相反，在酶活性測定中，毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽取食、外源水楊酸和外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理后POD 的活性僅在72 h時出現(xiàn)稍低于對照的情況，而pod 基因表達(dá)僅在72 h時稍高于對照水平7]，這可能是因為所測的pod基因的表達(dá)只是pod 基因家族中的一種，POD的活性變化不是完全由該基因調(diào)控的，而是由其他pod基因或者多個pod基因共同調(diào)控的結(jié)果。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源水楊酸甲酯誘導(dǎo)后，24 h后pod的表達(dá)量略有升高，48 h后達(dá)到較大值；機(jī)械損傷處理后pod在 24～96 h始終高于對照水平，48 h后達(dá)到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的趨勢，在96 h達(dá)最大值。外源信號物質(zhì)水楊酸甲酯和茉莉酸誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中pod的表達(dá)量。endprint

苯丙氨酸解氨酶是連接初級代謝和苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，廣泛存在于各種植物和少數(shù)微生物中，是植物防御物質(zhì)酚類化合物的關(guān)鍵酶，對植物生長發(fā)育以及抗逆反應(yīng)有重要作用。從春蕾等研究發(fā)現(xiàn)，PAL相對表達(dá)量對機(jī)械損傷的應(yīng)急變化僅為對照的137倍，明顯低于西花薊馬取食誘導(dǎo)的該基因的表達(dá)量。外源信號物質(zhì)MeSA誘導(dǎo)與西花薊馬取食誘導(dǎo)相似，也可以增加菜豆葉片中PAL的表達(dá)量，且效果更為明顯10]。毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽取食、機(jī)械損傷、外源SA和外源MeJA處理后的棉葉中pal表達(dá)量均升高，且外源信號物質(zhì)誘導(dǎo)與綠盲蝽取食誘導(dǎo)相似，其結(jié)果與本研究基本一致，但基因表達(dá)變化趨勢不一致7]，可能是由于綠盲蝽與西花薊馬的取食方式及取食的寄主植物不同造成的。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)后，pal的表達(dá)量均升高，機(jī)械損傷處理pal表達(dá)量與對照相比下降。外源信號物質(zhì)水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，也可以增加馬鈴薯葉片中pal的表達(dá)量。

本試驗首次對馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)馬鈴薯葉片中防御酶基因表達(dá)變化與外源信號物質(zhì)誘導(dǎo)的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖蛾取食可誘導(dǎo)水楊酸、茉莉酸介導(dǎo)的防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，pal、pod、cat 3個基因不完全調(diào)控相應(yīng)的酶活性。這些結(jié)果為探明馬鈴薯抗蟲的機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)，但要真正弄清楚馬鈴薯的防御反應(yīng)機(jī)制，還需對防御酶基因與防御酶活性的相關(guān)性作進(jìn)一步的探索和研究。

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