劉佳妮　胡昳　尹利方　張瑜瑜　徐勝光　張永福　陳澤斌　余磊

摘要：為探討馬鈴薯對(duì)馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）取食的防御反應(yīng)分子機(jī)制，在室內(nèi)條件下測(cè)定馬鈴薯塊莖蛾取食、機(jī)械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)處理后馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過(guò)氧化物酶（POD）基因（pod）和過(guò)氧化氫酶（CAT）基因（cat）的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)以健康植株為對(duì)照。結(jié)果表明：pal、pod和cat基因表達(dá)量變化趨勢(shì)存在差異，說(shuō)明馬鈴薯塊莖蛾取食既激活了水楊酸介導(dǎo)的防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也激活了茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且2個(gè)通路間存在交互作用。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯塊莖蛾；取食；防御酶；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S4334文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0112-03

收稿日期：2016-05-30

基金項(xiàng)目：云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2012FD044）。

作者簡(jiǎn)介：劉佳妮（1983—），女，云南昆明人，博士，副教授，主要從事昆蟲生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：ljn0131@163com。

通信作者：余磊，博士，教授，主要從事分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。E-mail：47067521@qqcom。

植物與植食性昆蟲長(zhǎng)期的相互作用形成了多種防御機(jī)制。在植物對(duì)昆蟲的化學(xué)防御體系中，除了利用體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)進(jìn)行直接防御外，其間接防御也起著相當(dāng)重要的作用。植物體在受到害蟲取食危害后，會(huì)釋放包括茉莉酸（jasmonic acid，簡(jiǎn)稱JA）、水楊酸（salicylic acid，簡(jiǎn)稱SA）和乙烯（ethene，簡(jiǎn)稱ET）等揮發(fā)性氣體的信號(hào)物質(zhì)。研究表明，JA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是蟲害和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的主要途徑，對(duì)植物抵御咀嚼式昆蟲危害非常重要，咀嚼式昆蟲咬食植物，其唾液分泌物能夠在取食位點(diǎn)直接產(chǎn)生幾丁質(zhì)或多聚糖，作為信號(hào)途徑的誘導(dǎo)因子。而這一系列變化同樣能夠被水楊酸甲酯（methyl salicylic，簡(jiǎn)稱MeSA）誘導(dǎo)產(chǎn)生。MeSA、JA作為與植物損傷相關(guān)的信號(hào)分子，共同參與植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)，一方面可以減弱防御反應(yīng)中活性氧等對(duì)細(xì)胞的損傷，另一方面可以增強(qiáng)協(xié)同抗性1]。Berenbaum的研究也發(fā)現(xiàn)，JA處理的植物與對(duì)照相比造成的昆蟲死亡率大大提高，害蟲危害程度減輕，植物對(duì)害蟲脅迫的抗性增強(qiáng)2-3]。

馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaea operculella （Zeller）]別稱煙草潛葉蛾、馬鈴薯麥蛾，隸屬鱗翅目（Lepidoptera）雙孔亞目（Ditrysia）麥蛾總科（Gelechioidea）麥蛾科（Gelechiidae）。該蟲最早記載于1854年，在澳大利亞發(fā)現(xiàn)該蟲危害煙草；國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的記載最早始于1937年，陳金壁報(bào)道該害蟲在廣西柳州危害煙草，現(xiàn)已廣泛分布于云南、貴州、廣西、湖南、湖北及臺(tái)灣地區(qū)等，且發(fā)生較為普遍，是一種重要的國(guó)際國(guó)內(nèi)檢疫性害蟲。該蟲寄主種類很多，主要危害茄科植物，其中以馬鈴薯、煙草、茄子等受害最重4]。目前對(duì)于馬鈴薯塊莖蛾的報(bào)道不多，并且還只是一些關(guān)于其發(fā)生規(guī)律、生理生殖和化學(xué)防治等層面的初步研究，還沒有更深層次的關(guān)于其生化及分子生物學(xué)等方面的相關(guān)研究。云南省地處西南山區(qū)，是國(guó)內(nèi)馬鈴薯和煙草主要的種植產(chǎn)區(qū)，隨著種植業(yè)的發(fā)展，馬鈴薯連作面積逐年增加，加上云南省近年來(lái)受全球氣候的影響，持續(xù)干旱的天氣也為該蟲的生存繁殖提供了適宜的氣候條件，使其病蟲危害逐年加重。本研究探討馬鈴薯塊莖蛾取食馬鈴薯后，植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過(guò)氧化物酶（POD）基因（pod）和過(guò)氧化氫酶（CAT）基因（cat）3種防御酶基因表達(dá)的變化，并與外源信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)的變化作對(duì)比，以期探討馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)激活的防御酶基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步探究馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)馬鈴薯防御反應(yīng)的機(jī)制和為害蟲治理、抗蟲植物的培育提供新的思路，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供必要的理論保障。

1材料與方法

11供試?yán)ハx和供試植物

馬鈴薯塊莖蛾：馬鈴薯塊莖蛾飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室內(nèi)，溫度控制在（27±2） ℃，相對(duì)濕度為80%～90%。在散射光照儲(chǔ)藏條件下的馬鈴薯塊莖上進(jìn)行飼養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h5]。

馬鈴薯植株：供試馬鈴薯植株均同期栽種于花盆中，并置于防蟲網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，待馬鈴薯幼苗生長(zhǎng)至4葉期時(shí)用于試驗(yàn)。

12植株處理

設(shè)置4種處理：（1）馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)（Phthorimaea operculella feeding，簡(jiǎn)稱POF）：每株馬鈴薯幼苗接種5頭馬鈴薯塊莖蛾成蟲（羽化后3 d未交配成蟲，接種前饑餓處理 12 h）放入防蟲網(wǎng)內(nèi)，取食24 h后取出成蟲。（2）機(jī)械損傷處理（mechanical acid，簡(jiǎn)稱MD）：用已消毒的注射器針頭（Φ=1 mm）在健康的馬鈴薯葉背面刺40次。以同期健康未受危害的馬鈴薯幼苗為對(duì)照（CK）。（3）外源茉莉酸誘導(dǎo)：以 01 mmolL 外源茉莉酸葉面噴施馬鈴薯葉片。（4）外源水楊酸甲酯誘導(dǎo)，以05 mmolL外源水楊酸甲酯葉面噴施馬鈴薯葉片。

每種處理盆栽馬鈴薯均分別置于不同的封閉玻璃容器中，分別在24、48、72、96 h取樣。以健康、未受傷的馬鈴薯植株作為對(duì)照（CK），取樣時(shí)間同上。取樣后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)使用1株馬鈴薯植株，本試驗(yàn)中所有的馬鈴薯植株都保持相同的生理狀態(tài)。

13總RNA提取

馬鈴薯葉片總RNA的提取采用TRIzol試劑（Invitrogen），按照操作說(shuō)明進(jìn)行提取。本試驗(yàn)中各處理和對(duì)照的葉片總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度與濃度。

14cDNA 合成endprint

按照RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）的操作方法，將以上各處理時(shí)間點(diǎn)的馬鈴薯葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或于-80 ℃貯藏備用。

15防御基因熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系，按照iTaqUniversal SYBR GreenSupermix 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。各反應(yīng)成分的含量為100 μL iTaqUniversal SYBR GreenSupermix（2×），各05 μL正向、反向引物，1 μL合成的cDNA模板，加水至20 μL，混勻、微離心后放入PCR儀內(nèi)擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)中設(shè)置空白對(duì)照，分別使用DNA和水為模板，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線。熒光定量引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用相對(duì)定量法檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下基因表達(dá)量的差異。

16數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析利用SPSS 180軟件。方差分析采用LSD多重比較法檢驗(yàn)處理間的差異顯著性（α=005）。

2結(jié)果與分析

21不同處理對(duì)馬鈴薯過(guò)氧化氫酶基因cat相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可見，與健康植株相比，4種處理下馬鈴薯葉片中cat基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后，cat的表達(dá)量顯著升高，96 h后基本恢復(fù)至對(duì)照水平；機(jī)械損傷處理后，cat表達(dá)量在24～96 h幾乎與對(duì)照水平相當(dāng)，沒有顯著變化；外源茉莉酸處理后，cat基因表達(dá)量先顯著低于對(duì)照水平，然后逐漸升高，僅在96 h時(shí)高于對(duì)照水平；外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達(dá)量的變化與馬鈴薯塊莖蛾取食基本相似。

FK（W11]TPLJN1tif]

22不同處理對(duì)馬鈴薯過(guò)氧化物酶基因pod相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后，pod的表達(dá)量略有升高，48 h后達(dá)到最大值，72 h后比對(duì)照稍低，96 h后基本恢復(fù)至24 h的水平；機(jī)械損傷處理后，pod表達(dá)量在24～96 h始終高于對(duì)照水平，48 h后達(dá)到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再降低再升高的趨勢(shì)，在96 h達(dá)最大值；外源水楊酸甲酯處理后，pod基因表達(dá)量變化與馬鈴薯塊莖蛾取食的基本相似。

FK（W11]TPLJN2tif]

23不同處理對(duì)馬鈴薯苯丙氨酸解氨酶基因pal相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖3可見，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達(dá)量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)24 h后pal的表達(dá)量顯著升高，隨后呈現(xiàn)出降低—升高的變化趨勢(shì)；機(jī)械損傷處理后，pal的表達(dá)量在24 h后升高，隨后一直降低，96 h時(shí)顯著低于對(duì)照水平；外源茉莉酸處理后，pal基因的表達(dá)量與對(duì)照相比變化不大；外源水楊酸甲酯處理后，48 h后pal基因表達(dá)量略有升高，96 h時(shí)達(dá)到最大值。

3討論

在自然系統(tǒng)中，植食性昆蟲取食誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，而植食性昆蟲通過(guò)改變自身來(lái)適應(yīng)植物的變化，兩者始終處于一種平衡狀態(tài)。之前的研究表明，PAL、POD、CAT 3種保護(hù)酶與植物的抗蟲能力密切相關(guān)。本研究通過(guò)馬鈴薯塊莖蛾取

FK（W11]TPLJN3tif]

食、機(jī)械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)處理后分析馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶基因（pal）、過(guò)氧化物酶基因（pod）和過(guò)氧化氫酶基因（cat）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，馬鈴薯葉片中3種酶基因在不同誘導(dǎo)條件和時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量均發(fā)生不同的變化。

過(guò)氧化氫酶是植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動(dòng)物的肝和紅細(xì)胞中，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。前人的研究發(fā)現(xiàn)，cat的表達(dá)量不僅與植物的發(fā)育時(shí)期、組織和器官有關(guān)，還與環(huán)境有很大關(guān)系6]。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源茉莉酸誘導(dǎo)后，馬鈴薯中cat的表達(dá)量先升高后基本恢復(fù)至對(duì)照水平，外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達(dá)量在96 h時(shí)高于對(duì)照水平。外源信號(hào)物質(zhì)水楊酸甲酯誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中cat的表達(dá)量。毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，cat基因表達(dá)量?jī)H在48 h時(shí)均低于對(duì)照水平，且變化較酶活性變化明顯7]，這可能與CAT活性由多種cat基因調(diào)控有關(guān)。

過(guò)氧化物酶是植物保護(hù)酶系的重要保護(hù)酶之一8]，它可以與超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶相互協(xié)調(diào)配合，清除過(guò)剩的自由基，使體內(nèi)自由基維持在正常的動(dòng)態(tài)水平，以提高植物的抗逆性。曾淑華等在對(duì)煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，傷害處理能使過(guò)氧化物酶基因pod的轉(zhuǎn)錄水平迅速提高，但是對(duì)SA卻無(wú)明顯反應(yīng)，而MeJA則抑制其表達(dá)9]。在棉花中已經(jīng)報(bào)道了12個(gè)編碼第三類過(guò)氧化物酶的基因。pod基因表達(dá)結(jié)果與POD活性測(cè)定結(jié)果相比可知，它們的變化趨勢(shì)恰好相反，在酶活性測(cè)定中，毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽取食、外源水楊酸和外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理后POD 的活性僅在72 h時(shí)出現(xiàn)稍低于對(duì)照的情況，而pod 基因表達(dá)僅在72 h時(shí)稍高于對(duì)照水平7]，這可能是因?yàn)樗鶞y(cè)的pod基因的表達(dá)只是pod 基因家族中的一種，POD的活性變化不是完全由該基因調(diào)控的，而是由其他pod基因或者多個(gè)pod基因共同調(diào)控的結(jié)果。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源水楊酸甲酯誘導(dǎo)后，24 h后pod的表達(dá)量略有升高，48 h后達(dá)到較大值；機(jī)械損傷處理后pod在 24～96 h始終高于對(duì)照水平，48 h后達(dá)到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高再降低再升高的趨勢(shì)，在96 h達(dá)最大值。外源信號(hào)物質(zhì)水楊酸甲酯和茉莉酸誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中pod的表達(dá)量。endprint

苯丙氨酸解氨酶是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，廣泛存在于各種植物和少數(shù)微生物中，是植物防御物質(zhì)酚類化合物的關(guān)鍵酶，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆反應(yīng)有重要作用。從春蕾等研究發(fā)現(xiàn)，PAL相對(duì)表達(dá)量對(duì)機(jī)械損傷的應(yīng)急變化僅為對(duì)照的137倍，明顯低于西花薊馬取食誘導(dǎo)的該基因的表達(dá)量。外源信號(hào)物質(zhì)MeSA誘導(dǎo)與西花薊馬取食誘導(dǎo)相似，也可以增加菜豆葉片中PAL的表達(dá)量，且效果更為明顯10]。毛紅等研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽取食、機(jī)械損傷、外源SA和外源MeJA處理后的棉葉中pal表達(dá)量均升高，且外源信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)與綠盲蝽取食誘導(dǎo)相似，其結(jié)果與本研究基本一致，但基因表達(dá)變化趨勢(shì)不一致7]，可能是由于綠盲蝽與西花薊馬的取食方式及取食的寄主植物不同造成的。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)后，pal的表達(dá)量均升高，機(jī)械損傷處理pal表達(dá)量與對(duì)照相比下降。外源信號(hào)物質(zhì)水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導(dǎo)與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，也可以增加馬鈴薯葉片中pal的表達(dá)量。

本試驗(yàn)首次對(duì)馬鈴薯塊莖蛾取食誘導(dǎo)馬鈴薯葉片中防御酶基因表達(dá)變化與外源信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖蛾取食可誘導(dǎo)水楊酸、茉莉酸介導(dǎo)的防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，pal、pod、cat 3個(gè)基因不完全調(diào)控相應(yīng)的酶活性。這些結(jié)果為探明馬鈴薯抗蟲的機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)，但要真正弄清楚馬鈴薯的防御反應(yīng)機(jī)制，還需對(duì)防御酶基因與防御酶活性的相關(guān)性作進(jìn)一步的探索和研究。

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