劉佳妮　胡昳　尹利方　張瑜瑜　徐勝光　張永?！￡悵杀蟆∮嗬?/p>

摘要：為探討馬鈴薯對馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）取食的防御反應分子機制，在室內條件下測定馬鈴薯塊莖蛾取食、機械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導處理后馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過氧化物酶（POD）基因（pod）和過氧化氫酶（CAT）基因（cat）的相對表達量，同時以健康植株為對照。結果表明：pal、pod和cat基因表達量變化趨勢存在差異，說明馬鈴薯塊莖蛾取食既激活了水楊酸介導的防御信號轉導途徑，也激活了茉莉酸介導的信號轉導途徑，并且2個通路間存在交互作用。

關鍵詞：馬鈴薯塊莖蛾；取食；防御酶；基因表達

中圖分類號： S4334文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0112-03

收稿日期：2016-05-30

基金項目：云南省科技廳應用基礎研究計劃（編號：2012FD044）。

作者簡介：劉佳妮（1983—），女，云南昆明人，博士，副教授，主要從事昆蟲生態(tài)學和分子生物學方面的研究。E-mail：ljn0131@163com。

通信作者：余磊，博士，教授，主要從事分子生物學和蛋白質組學方面的研究。E-mail：47067521@qqcom。

植物與植食性昆蟲長期的相互作用形成了多種防御機制。在植物對昆蟲的化學防御體系中，除了利用體內的次生代謝物質進行直接防御外，其間接防御也起著相當重要的作用。植物體在受到害蟲取食危害后，會釋放包括茉莉酸（jasmonic acid，簡稱JA）、水楊酸（salicylic acid，簡稱SA）和乙烯（ethene，簡稱ET）等揮發(fā)性氣體的信號物質。研究表明，JA介導的信號轉導途徑是蟲害和創(chuàng)傷誘導的主要途徑，對植物抵御咀嚼式昆蟲危害非常重要，咀嚼式昆蟲咬食植物，其唾液分泌物能夠在取食位點直接產生幾丁質或多聚糖，作為信號途徑的誘導因子。而這一系列變化同樣能夠被水楊酸甲酯（methyl salicylic，簡稱MeSA）誘導產生。MeSA、JA作為與植物損傷相關的信號分子，共同參與植物防御反應的誘導，一方面可以減弱防御反應中活性氧等對細胞的損傷，另一方面可以增強協(xié)同抗性1]。Berenbaum的研究也發(fā)現，JA處理的植物與對照相比造成的昆蟲死亡率大大提高，害蟲危害程度減輕，植物對害蟲脅迫的抗性增強2-3]。

馬鈴薯塊莖蛾Phthorimaea operculella （Zeller）]別稱煙草潛葉蛾、馬鈴薯麥蛾，隸屬鱗翅目（Lepidoptera）雙孔亞目（Ditrysia）麥蛾總科（Gelechioidea）麥蛾科（Gelechiidae）。該蟲最早記載于1854年，在澳大利亞發(fā)現該蟲危害煙草；國內對馬鈴薯塊莖蛾的記載最早始于1937年，陳金壁報道該害蟲在廣西柳州危害煙草，現已廣泛分布于云南、貴州、廣西、湖南、湖北及臺灣地區(qū)等，且發(fā)生較為普遍，是一種重要的國際國內檢疫性害蟲。該蟲寄主種類很多，主要危害茄科植物，其中以馬鈴薯、煙草、茄子等受害最重4]。目前對于馬鈴薯塊莖蛾的報道不多，并且還只是一些關于其發(fā)生規(guī)律、生理生殖和化學防治等層面的初步研究，還沒有更深層次的關于其生化及分子生物學等方面的相關研究。云南省地處西南山區(qū)，是國內馬鈴薯和煙草主要的種植產區(qū)，隨著種植業(yè)的發(fā)展，馬鈴薯連作面積逐年增加，加上云南省近年來受全球氣候的影響，持續(xù)干旱的天氣也為該蟲的生存繁殖提供了適宜的氣候條件，使其病蟲危害逐年加重。本研究探討馬鈴薯塊莖蛾取食馬鈴薯后，植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因（pal）、過氧化物酶（POD）基因（pod）和過氧化氫酶（CAT）基因（cat）3種防御酶基因表達的變化，并與外源信號物質誘導的變化作對比，以期探討馬鈴薯塊莖蛾取食誘導激活的防御酶基因表達的動態(tài)變化，為進一步探究馬鈴薯塊莖蛾取食誘導馬鈴薯防御反應的機制和為害蟲治理、抗蟲植物的培育提供新的思路，為農業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供必要的理論保障。

1材料與方法

11供試昆蟲和供試植物

馬鈴薯塊莖蛾：馬鈴薯塊莖蛾飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲室內，溫度控制在（27±2） ℃，相對濕度為80%～90%。在散射光照儲藏條件下的馬鈴薯塊莖上進行飼養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h5]。

馬鈴薯植株：供試馬鈴薯植株均同期栽種于花盆中，并置于防蟲網室內培養(yǎng)，待馬鈴薯幼苗生長至4葉期時用于試驗。

12植株處理

設置4種處理：（1）馬鈴薯塊莖蛾取食誘導（Phthorimaea operculella feeding，簡稱POF）：每株馬鈴薯幼苗接種5頭馬鈴薯塊莖蛾成蟲（羽化后3 d未交配成蟲，接種前饑餓處理 12 h）放入防蟲網內，取食24 h后取出成蟲。（2）機械損傷處理（mechanical acid，簡稱MD）：用已消毒的注射器針頭（Φ=1 mm）在健康的馬鈴薯葉背面刺40次。以同期健康未受危害的馬鈴薯幼苗為對照（CK）。（3）外源茉莉酸誘導：以 01 mmolL 外源茉莉酸葉面噴施馬鈴薯葉片。（4）外源水楊酸甲酯誘導，以05 mmolL外源水楊酸甲酯葉面噴施馬鈴薯葉片。

每種處理盆栽馬鈴薯均分別置于不同的封閉玻璃容器中，分別在24、48、72、96 h取樣。以健康、未受傷的馬鈴薯植株作為對照（CK），取樣時間同上。取樣后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫總€處理重復3次，每次重復使用1株馬鈴薯植株，本試驗中所有的馬鈴薯植株都保持相同的生理狀態(tài)。

13總RNA提取

馬鈴薯葉片總RNA的提取采用TRIzol試劑（Invitrogen），按照操作說明進行提取。本試驗中各處理和對照的葉片總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外-可見分光光度計檢測RNA的純度與濃度。

14cDNA 合成endprint

按照RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）的操作方法，將以上各處理時間點的馬鈴薯葉片總RNA進行反轉錄合成第1鏈cDNA。獲得的cDNA產物直接用于PCR或于-80 ℃貯藏備用。

15防御基因熒光定量PCR

實時熒光定量PCR采用20 μL反應體系，按照iTaqUniversal SYBR GreenSupermix 試劑盒說明進行操作。各反應成分的含量為100 μL iTaqUniversal SYBR GreenSupermix（2×），各05 μL正向、反向引物，1 μL合成的cDNA模板，加水至20 μL，混勻、微離心后放入PCR儀內擴增。反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)。反應中設置空白對照，分別使用DNA和水為模板，每個樣品重復3次。反應結束后分析熒光值變化曲線。熒光定量引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用相對定量法檢測不同處理條件下基因表達量的差異。

16數據統(tǒng)計分析

數據分析利用SPSS 180軟件。方差分析采用LSD多重比較法檢驗處理間的差異顯著性（α=005）。

2結果與分析

21不同處理對馬鈴薯過氧化氫酶基因cat相對表達量的影響

由圖1可見，與健康植株相比，4種處理下馬鈴薯葉片中cat基因表達量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導24 h后，cat的表達量顯著升高，96 h后基本恢復至對照水平；機械損傷處理后，cat表達量在24～96 h幾乎與對照水平相當，沒有顯著變化；外源茉莉酸處理后，cat基因表達量先顯著低于對照水平，然后逐漸升高，僅在96 h時高于對照水平；外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達量的變化與馬鈴薯塊莖蛾取食基本相似。

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22不同處理對馬鈴薯過氧化物酶基因pod相對表達量的影響

由圖2可知，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導24 h后，pod的表達量略有升高，48 h后達到最大值，72 h后比對照稍低，96 h后基本恢復至24 h的水平；機械損傷處理后，pod表達量在24～96 h始終高于對照水平，48 h后達到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達量呈現先升高再降低再升高的趨勢，在96 h達最大值；外源水楊酸甲酯處理后，pod基因表達量變化與馬鈴薯塊莖蛾取食的基本相似。

FK（W11]TPLJN2tif]

23不同處理對馬鈴薯苯丙氨酸解氨酶基因pal相對表達量的影響

由圖3可見，與健康植株相比，4種處理后馬鈴薯葉片中pod基因表達量均有不同程度的變化。馬鈴薯塊莖蛾取食誘導24 h后pal的表達量顯著升高，隨后呈現出降低—升高的變化趨勢；機械損傷處理后，pal的表達量在24 h后升高，隨后一直降低，96 h時顯著低于對照水平；外源茉莉酸處理后，pal基因的表達量與對照相比變化不大；外源水楊酸甲酯處理后，48 h后pal基因表達量略有升高，96 h時達到最大值。

3討論

在自然系統(tǒng)中，植食性昆蟲取食誘導植物產生防御反應，而植食性昆蟲通過改變自身來適應植物的變化，兩者始終處于一種平衡狀態(tài)。之前的研究表明，PAL、POD、CAT 3種保護酶與植物的抗蟲能力密切相關。本研究通過馬鈴薯塊莖蛾取

FK（W11]TPLJN3tif]

食、機械損傷、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導處理后分析馬鈴薯葉片中苯丙氨酸解氨酶基因（pal）、過氧化物酶基因（pod）和過氧化氫酶基因（cat）的相對表達量。結果表明，馬鈴薯葉片中3種酶基因在不同誘導條件和時間下的相對表達量均發(fā)生不同的變化。

過氧化氫酶是植物體內的抗氧化物質，普遍存在于能呼吸的生物體內，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內質網、動物的肝和紅細胞中，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理。前人的研究發(fā)現，cat的表達量不僅與植物的發(fā)育時期、組織和器官有關，還與環(huán)境有很大關系6]。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源茉莉酸誘導后，馬鈴薯中cat的表達量先升高后基本恢復至對照水平，外源水楊酸甲酯處理后，cat基因表達量在96 h時高于對照水平。外源信號物質水楊酸甲酯誘導與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中cat的表達量。毛紅等研究發(fā)現，cat基因表達量僅在48 h時均低于對照水平，且變化較酶活性變化明顯7]，這可能與CAT活性由多種cat基因調控有關。

過氧化物酶是植物保護酶系的重要保護酶之一8]，它可以與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶相互協(xié)調配合，清除過剩的自由基，使體內自由基維持在正常的動態(tài)水平，以提高植物的抗逆性。曾淑華等在對煙草的研究中發(fā)現，傷害處理能使過氧化物酶基因pod的轉錄水平迅速提高，但是對SA卻無明顯反應，而MeJA則抑制其表達9]。在棉花中已經報道了12個編碼第三類過氧化物酶的基因。pod基因表達結果與POD活性測定結果相比可知，它們的變化趨勢恰好相反，在酶活性測定中，毛紅等研究發(fā)現，綠盲蝽取食、外源水楊酸和外源茉莉酸甲酯誘導處理后POD 的活性僅在72 h時出現稍低于對照的情況，而pod 基因表達僅在72 h時稍高于對照水平7]，這可能是因為所測的pod基因的表達只是pod 基因家族中的一種，POD的活性變化不是完全由該基因調控的，而是由其他pod基因或者多個pod基因共同調控的結果。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食和外源水楊酸甲酯誘導后，24 h后pod的表達量略有升高，48 h后達到較大值；機械損傷處理后pod在 24～96 h始終高于對照水平，48 h后達到最大值；外源茉莉酸處理后，pod基因表達量呈現出先升高再降低再升高的趨勢，在96 h達最大值。外源信號物質水楊酸甲酯和茉莉酸誘導與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，可增加馬鈴薯葉片中pod的表達量。endprint

苯丙氨酸解氨酶是連接初級代謝和苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶，廣泛存在于各種植物和少數微生物中，是植物防御物質酚類化合物的關鍵酶，對植物生長發(fā)育以及抗逆反應有重要作用。從春蕾等研究發(fā)現，PAL相對表達量對機械損傷的應急變化僅為對照的137倍，明顯低于西花薊馬取食誘導的該基因的表達量。外源信號物質MeSA誘導與西花薊馬取食誘導相似，也可以增加菜豆葉片中PAL的表達量，且效果更為明顯10]。毛紅等研究發(fā)現，綠盲蝽取食、機械損傷、外源SA和外源MeJA處理后的棉葉中pal表達量均升高，且外源信號物質誘導與綠盲蝽取食誘導相似，其結果與本研究基本一致，但基因表達變化趨勢不一致7]，可能是由于綠盲蝽與西花薊馬的取食方式及取食的寄主植物不同造成的。本研究中馬鈴薯塊莖蛾取食、外源水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導后，pal的表達量均升高，機械損傷處理pal表達量與對照相比下降。外源信號物質水楊酸甲酯和外源茉莉酸誘導與馬鈴薯塊莖蛾取食一樣，也可以增加馬鈴薯葉片中pal的表達量。

本試驗首次對馬鈴薯塊莖蛾取食誘導馬鈴薯葉片中防御酶基因表達變化與外源信號物質誘導的結果進行比較，發(fā)現馬鈴薯塊莖蛾取食可誘導水楊酸、茉莉酸介導的防御信號轉導途徑，pal、pod、cat 3個基因不完全調控相應的酶活性。這些結果為探明馬鈴薯抗蟲的機制提供了一定理論基礎，但要真正弄清楚馬鈴薯的防御反應機制，還需對防御酶基因與防御酶活性的相關性作進一步的探索和研究。

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