陳洪娜　李建文　孫文秀

摘要：測(cè)定湖北省不同地區(qū)水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性菌株的抗藥性水平不高。根據(jù)常見植物病原真菌β-微管蛋白基因設(shè)計(jì)引物，從水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈的敏感和抗性菌株中擴(kuò)增β-微管蛋白基因，均獲得了大小為695 bp的基因片段，其中含有1個(gè)53 bp的內(nèi)含子，與粗糙脈孢菌具有較高的同源性。序列分析結(jié)果表明，水稻紋枯病病菌抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，分別由T、T、T突變?yōu)镚、C、C，但這3個(gè)位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的氨基酸卻沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。由此可見，水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈抗藥性的產(chǎn)生與β-微管蛋白基因的變異有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：湖北??；水稻紋枯病病菌；β-微管蛋白；基因克隆；多菌靈抗藥性；堿基突變

中圖分類號(hào)： S4351114+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0106-03

收稿日期：2016-06-14

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)江大學(xué)長(zhǎng)江青年人才基金（編號(hào)：2015cqr18）；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放基金（編號(hào)：KF201410）。

作者簡(jiǎn)介：陳洪娜（1992—），女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：1242952938@qqcom。

通信作者：孫文秀，博士，副教授，主要從事植物病害的生物防治研究。Tel：（0716）8066257；E-mail：wenxiusun@163com。

水稻是我國(guó)主要的糧食作物之一，在全球的糧食生產(chǎn)和供應(yīng)中占有重要地位。在水稻生長(zhǎng)和生產(chǎn)過程中，水稻紋枯病的發(fā)生嚴(yán)重影響了其質(zhì)量和產(chǎn)量，給我國(guó)及世界各國(guó)的經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）侵染引起，該病原菌寄主范圍廣、變異快、易產(chǎn)生抗藥性。目前，主要采用化學(xué)藥劑防治水稻紋枯病，卻也導(dǎo)致了病原菌抗藥性的產(chǎn)生并呈上升趨勢(shì)。

苯并咪唑類殺菌劑能夠通過與病原菌β-微管蛋白結(jié)合，影響微管的形成或使已形成的微管解聚，阻止細(xì)胞的有絲分裂1]，從而達(dá)到抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖和侵入。但由于該類殺菌劑作用位點(diǎn)單一、選擇性強(qiáng)，使得病原菌在藥劑選擇壓力下易產(chǎn)生抗藥性2]。其中，多菌靈是一種應(yīng)用廣泛的廣譜性殺菌劑，對(duì)多種作物由真菌引起的病害具有良好的防治效果，但也產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物病原菌抗多菌靈菌株的突變位點(diǎn)發(fā)生在β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸上3-5]，使氨基酸的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，降低了藥劑的親和力6]。但也有因?yàn)棣?微管蛋白其他位點(diǎn)突變而引起病原菌抗多菌靈的研究報(bào)道7-12]。更有研究表明，β-微管蛋白不同氨基酸位點(diǎn)的突變可以引起病原菌對(duì)多菌靈敏感性的差異13]。目前尚未見到有關(guān)水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈抗藥性的研究報(bào)道，本研究以篩選到的多菌靈敏感性和抗性菌株為試驗(yàn)材料，對(duì)β-微管蛋白基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，以明確β-微管蛋白是否發(fā)生基因突變，探索水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111供試菌株

2014年從湖北武漢、荊州、宜昌等地區(qū)采集水稻紋枯病病株并進(jìn)行分離純化，共獲得134株菌株。在含有10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水）上進(jìn)行抗性和敏感性菌株的篩選，隨機(jī)選取3株抗性菌株wkb2、wka3、wkd3和3株敏感性菌株wka2、wkb3、wkc1用于本研究。

112主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)DH5α和pEASY-T1載體，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨卡青霉素（Amp）、X-gal、IPTG、dNTP、T4 DNA連接酶和Taq酶，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

12試驗(yàn)方法

121藥劑敏感性測(cè)定

將3個(gè)敏感菌株分別接種在含0、02、04、06、08、10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上，再將3個(gè)抗性菌株分別接種在含0、10、12、14、16、18 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下培養(yǎng)2 d，十字交叉法測(cè)量各菌落的直徑。通過對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率和藥劑的有效濃度對(duì)數(shù)值之間的線性回歸分析，求出藥劑的EC50，測(cè)定供試菌株對(duì)多菌靈的敏感性表型。

122基因組DNA的提取

將供試菌株菌塊接種到PD液體培養(yǎng)基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 000 mL蒸餾水）中，25 ℃振蕩培養(yǎng)，5 d后無(wú)菌過濾收集菌絲，凍干，液氮研磨。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

123PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)已知植物病原真菌β-微管蛋白基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物為Rs-F（3′-GTGAGTGAGAACJP3]CACCTCCA-5′）和Rs-R（3′-ACGTTGTTGG GGATCCACTC-5′），以供試菌株基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α。在含Amp、X-gal、IPTG的LB平板（10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g NaCl、15 g瓊脂、1 000 mL 蒸餾水）上篩選白色菌落，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送至濟(jì)南博尚生物科技公司測(cè)序。

124序列分析

采用DNAclub軟件分析序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比較，比較水稻紋枯病病菌抗、感菌株β-微管蛋白基因片段的核苷酸和氨基酸序列，找出突變位點(diǎn)。endprint

2結(jié)果與分析

21水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈的敏感性測(cè)定

測(cè)定從湖北省分離獲得的水稻紋枯病病菌菌株對(duì)多菌靈的敏感性，發(fā)現(xiàn)2313%的菌株在含有10 μgmL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)，表明產(chǎn)生了一定的抗藥性14]。分別測(cè)定供試6個(gè)菌株對(duì)多菌靈的敏感性，結(jié)果如表1所示，敏感性菌株對(duì)多菌靈的EC50平均值為0301 2 μgmL，抗性菌株對(duì)多菌靈的EC50平均值為0613 4 μgmL，說明菌株的抗藥性水平不高，多菌靈可以繼續(xù)用來防治水稻紋枯病。

22序列分析

通過引物Rs-F和Rs-R對(duì)供試水稻紋枯病病菌的β-微管蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果表明，6個(gè)菌株均獲得了同等大小的基因片段，片段長(zhǎng)度為695 bp，其核苷酸序列與菌株AG-1-IA的β-微管蛋白基因同源性達(dá)999%。同時(shí)，通過與典型模式菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的β-微管蛋白基因比較發(fā)現(xiàn)，供試水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因片段均含有53 bp的內(nèi)含子，其位置與粗糙脈孢菌的內(nèi)含子6相似15]，可以明確該片段為β-微管蛋白基因。由圖1可知，抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，即敏感菌株中分別為T、T、T，抗性菌株中分別突變?yōu)镚、C、C，且突變率為100%，但這3個(gè)位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的氨基酸卻沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。而報(bào)道較多的第198、第200位氨基酸并未發(fā)生突變。

FK（W20]TPCHN1tif；S+2mm]

3討論與結(jié)論

大多數(shù)研究表明，植物病原真菌對(duì)多菌靈的抗藥性與 β-微管蛋白基因變異有關(guān)，且由個(gè)別堿基突變導(dǎo)致氨基酸變異，從而產(chǎn)生抗藥性。報(bào)道最多的是β-微管蛋白的第198、第200位氨基酸發(fā)生突變。例如，粗糙脈孢菌（N crassa）抗性菌株中β-微管蛋白的第198位氨基酸由甘氨酸變成了谷氨酸，第200位氨基酸由苯丙氨酸變成了酪氨酸3]；油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）β-微管蛋白的第198位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)楸彼?6]；膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第200位氨基酸由苯丙氨酸突變成了酪氨酸17]；小麥赤霉病病菌（Gibberella zeae）Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)槔野彼?，Js519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸變?yōu)楣劝滨０?8]等。除此之外，芒果炭疽病病菌（C gloeosporioides）抗性菌株β-微管蛋白的第181、第237、第363位氨基酸發(fā)生了突變，而其他位置（如第198位或第200位）均不變19]。也有研究表明，一些植物病原真菌對(duì)多菌靈抗藥性的產(chǎn)生與 β-微管蛋白基因無(wú)關(guān)，如水稻惡苗病病菌（Fusarium fujikuroi）20]、禾谷鐮孢菌（F graminearum）21]等。

本研究通過測(cè)定水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈的敏感性發(fā)現(xiàn)抗藥性水平不高，可以將多菌靈和井岡霉素交替使用來防治水稻紋枯病，防止抗藥性的產(chǎn)生和提高。比較了抗、感菌株的β-微管蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)第271、第453、第612位堿基發(fā)生了突變，敏感菌株中分別為T、T、T，而抗性菌株中分別為G、C、C，但這3個(gè)位點(diǎn)堿基的突變卻沒有導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生變化。而且報(bào)道較多的第198、第200位氨基酸也未發(fā)生突變。此外，內(nèi)含子的第15位堿基由G突變?yōu)锳。這些突變均有可能導(dǎo)致水稻紋枯病病菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性，也說明該病原菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制與其他真菌可能相同，但還有待于進(jìn)一步確認(rèn)這3個(gè)位點(diǎn)突變與多菌靈抗藥性之間的關(guān)系。

上述研究結(jié)果表明，在對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性的植物病原真菌中，β-微管蛋白基因的突變沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律。本研究中水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因堿基的突變沒有引起氨基酸的變化，可能與多菌靈的抗藥性水平有一定的關(guān)系。此外，設(shè)計(jì)引物時(shí)主要考慮了第198、第200位的氨基酸位點(diǎn)，獲得的β-微管蛋白基因沒有包含全部突變位點(diǎn)，使本研究結(jié)果與以往報(bào)道不一致。為此，在本研究的基礎(chǔ)上通過單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子標(biāo)記技術(shù)22]進(jìn)一步分析水稻紋枯病病菌β-微管蛋白基因單個(gè)堿基的突變與多菌靈抗藥性之間的關(guān)系，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)抗性菌株和監(jiān)測(cè)抗性群體發(fā)展動(dòng)態(tài)的方法，這對(duì)于治理抗藥性、延長(zhǎng)藥劑的使用壽命及降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。

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