楊俊譽　陳小龍　高玲玲　黃瓊

摘要：從云南省感染水稻白葉枯病的病株和健康植株上共分離得到475株植株內生細菌，從中篩選出167株對水稻白葉枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，簡稱Xoo）有拮抗作用的內生細菌。病株體內拮抗內生細菌的菌株數量多于健康植株，病株和健康植株根、莖、葉中的內生細菌菌株數量略有不同，從病株根、莖、葉中分離出的拮抗內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑制作用差異不顯著；而從健康植株的莖部和葉部分離出的拮抗菌對水稻白葉枯病病菌的抑制作用顯著高于根部拮抗菌（P<005）。采用對峙培養(yǎng)方法測定并比較分離菌株的抑菌能力，得到30株對白葉枯病菌抑菌能力較強的菌株，并對其進行5種病菌的抑菌譜測定。結果顯示，30株菌株對5種水稻病害的病原菌均有抑制作用。通過16S rDNA序列分析發(fā)現，水稻內生拮抗細菌分別與GenBank序列數據庫中17個屬的細菌相似性較高，其中，農桿菌屬（Agrobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為發(fā)病植株特有的拮抗細菌屬，而節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和考克斯菌屬（Kocuria）僅存在于對照植株中。

關鍵詞：水稻白葉枯病病菌；內生細菌；拮抗細菌；抑菌譜；16S rDNA；種群結構

中圖分類號： S4351114+7文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0100-06

收稿日期：2016-05-25

基金項目：公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（編號：201303015）。

作者簡介：楊俊譽（1990—），男，云南楚雄人，碩士研究生，主要從事植物細菌病害研究，E-mail：yangjunyu900708@163com；陳小龍（1982—），男，河南安陽人，博士，主要從事植物病理學研究，E-mail：cxlong119@163com。

通信作者：黃瓊，博士，教授，主要從事植物病理學研究。E-mail：huangqiong88hs@163com。

水稻是我國主要的糧食作物，由水稻白葉枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，簡稱Xoo）引起的水稻白葉枯病是水稻生產上一種重要的細菌性病害1-2]。自1884年水稻白葉枯病首次在日本九州島福岡地區(qū)被發(fā)現，至今已有120多年的歷史，盡管一些化學農藥已在生產上用于防治該病，但效果并不十分理想。

Bayot等對植物內生細菌的種類、定殖部位以及與植物的生理與病理的相關關系進行了大量的研究3]。Kennedy等報道，大多數植物內生細菌具有一定的運動性，這不僅有利于內生細菌吸收營養(yǎng)物質，還有利于其避開外界環(huán)境的壓力以保護自己4]。同時大多數內生細菌定殖于植物薄壁組織的細胞間隙，有些定殖于細胞質中，有些可穿過細胞壁進入細胞內，有些則定殖于微管束組織中，但數量較少，可能是因為維管束中出現大量的細菌會導致維管束阻塞，使植物致病5-6]。研究發(fā)現，不同寄主植物品種中內生細菌的種群不同，即使是同一種植物的不同品種之間，其內生細菌的種類、數量和分布均有一定甚至較大的差異7-9]。

利用內生細菌防治水稻白葉枯病已有較多的研究，但是關于白葉枯病的發(fā)生對水稻內生細菌的分布和拮抗作用的影響鮮見報道。本研究分析白葉枯病的發(fā)生對水稻拮抗內生細菌的種類以及分布特性的影響，旨在為水稻白葉枯病的防治及水稻拮抗內生細菌的開發(fā)與利用奠定基礎。

1材料與方法

11試驗材料

111供試內生細菌

樣品采集于云南省紅河州植物保護站試驗田（23°24′N，103°21′E）。水稻品種為宜香2239，對水稻白葉枯病表現為中抗。在水稻孕穗期自然發(fā)病的田塊進行采樣，病株和健康植株（對照）來自于同一試驗田的同一品種。試驗田中共有2個發(fā)病位置，在發(fā)病區(qū)域內呈“S”形取樣，采集病株共計30叢；并于發(fā)病植株與健康植株的交界處周圍10 m的位置采集健康植株共計30叢，采集的樣品生長狀態(tài)一致。

112供試植物病原細菌和真菌

2種病原細菌分別為水稻白葉枯病病菌、水稻細菌性條斑病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzicola），3種病原真菌分別為水稻稻瘟病病菌（Pyricularia oryzae Cav）、紋枯病病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、惡苗病病菌（Fusariun moniliforme Sheld），上述5種病原菌均由筆者所在實驗室提供。

12試驗方法

121水稻內生細菌的分離

樣品用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后分別稱取1 g根、莖、葉進行表面滅菌10]。其中發(fā)病植株根、莖、葉內生細菌的分離選擇病健交界處，而對照植株選取3個大小、位置均與發(fā)病植株一致的部位進行分離。將經表面消毒的材料置于已滅菌的研缽中碾磨至糊漿狀，加入9 mL滅菌水，靜置15 min，再取200 μL上清液涂布于NA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》中的平板菌落計數法進行細菌數量的統(tǒng)計，采用《伯杰氏細菌鑒定手冊》中的細菌常規(guī)鑒定法進行細菌的分類鑒定11]，確定具有相同菌落形態(tài)的細菌歸為一類。同時挑選菌落形態(tài)、色澤等特征有差異的單菌落，于NA培養(yǎng)基上劃線純化，最終將純化的細菌菌落移入含NA培養(yǎng)基的試管中，并保存于4 ℃冰箱中備用。

122拮抗內生細菌的篩選

1221對水稻白葉枯病病菌和水稻細菌性條斑病病菌的拮抗作用

取200 μL病原細菌懸浮液于NA平板上，均勻涂布后吹干，平板中心放置直徑為5 mm的圓形滅菌濾紙片，取5 μL分離保存的內生細菌經活化后的菌液接種在濾紙片上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h后觀察和測量抑菌圈的直徑。每個處理3次重復。endprint

1222對水稻稻瘟病病菌、紋枯病病菌、惡苗病病菌的抑制作用

使用PDA培養(yǎng)基活化各病原真菌12]，用直徑為 6 mm 的打孔器打出病原真菌的菌餅，用接種針將菌餅放置在新鮮的PDA培養(yǎng)平板中心，然后在距離菌餅2 cm處用滅菌牙簽采用3點接種法接種拮抗菌株，3個重復，并以不接種拮抗菌株作為對照，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。當對照中的菌落長滿整個培養(yǎng)皿時，測量具有抑菌現象菌株的抑菌圈直徑。

123拮抗內生細菌的分子鑒定

1231拮抗內生細菌的PCR鑒定

基因組DNA的制備選用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）13]。利用細菌 16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對具有拮抗作用的內生細菌進行16S rDNA PCR擴增14-15]。引物合成和測序工作均由深圳華大基因科技有限公司完成。

1232拮抗內生細菌的鑒定及16S rDNA序列分析

采用細菌常規(guī)鑒定法對具有拮抗作用的細菌菌株進行形態(tài)學分類11]，選取具有不同菌落形態(tài)和拮抗功能的代表菌株進行16S rDNA序列測定。利用Blast程序在GenBank序列數據庫中獲取同源性最高的菌株登錄號（http：wwwncbinlmnihgovblastBlastcgi），定義16S rDNA序列同源性大于97%的菌株為同一個種16]。并向NCBI數據庫提交上述菌株序列，獲得其基因登錄號。同時對根、莖、葉中分離的所有內生拮抗菌株數量進行統(tǒng)計，確定感染白葉枯病病菌的水稻植株與健康水稻植株中內生拮抗細菌種群菌株數量的比例分布，并用該比例定義為細菌種群的結構分布，為拮抗內生細菌的篩選奠定基礎。

13數據統(tǒng)計方法

采用Excel 2007對數據進行處理和繪圖，運用SPSS 200統(tǒng)計分析軟件對數據進行t檢驗和方差分析，顯著性水平設定為P<005。

2結果與分析

21水稻內生細菌的分離

通過對健康植株根、莖、葉進行水稻白葉枯病病菌的分離，10-1～10-8 CFUg懸浮液在NA平板上均沒有分離到水稻白葉枯病病菌，表明對照植株為不帶白葉枯病病菌的樣品。

本研究從水稻白葉枯病株和健康植株植物組織中共獲得475株內生細菌，所有分離得到的內生細菌單個菌株種群數量平均值為69×105 CFUg。其中，從病株中共分離出229株內生細菌，根部99株，莖部58株，葉部72株；JP3]從健康植株中共分離出246株內生細菌，根部106株，莖部62株，葉部78株。

22拮抗內生細菌的篩選

由表1可知，從475株內生細菌中共篩選出167株對水稻白葉枯病病菌有拮抗作用的內生細菌菌株，其中在病株上獲得93株，在對照植株上獲得74株，在發(fā)病植株內分離得到的拮抗內生細菌的菌株數量多于對照植株。從水稻植株不同部位分離得到的內生細菌菌株數量存在明顯的差異，病株中不同部位分離得到的菌株株數表現為葉>根>莖，而對照植株中不同部位分離得到的菌株株數表現為根>葉>莖。經白葉枯病病菌對峙培養(yǎng)試驗測定抑菌效果，組3、組4的抑菌效果較好，組1的抑菌效果最差。拮抗內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑菌直徑在30～80 mm之間的組2，其拮抗細菌的菌株數量在發(fā)病植株和對照植株中差異較大。

由表2可知，比較發(fā)病植株和對照植株的內生細菌對水稻白葉枯病菌的抑菌圈直徑得出，在組1（F=0421，P>005）、組2（F=1179，P>005）和組3（F=0757，P>005）中差異不顯著；而組4中發(fā)病植株內生細菌的抑菌圈直徑顯著大于對照植株（F=5922，P<005），其中發(fā)病植株和對照植株莖（F=0022，P>005）、葉（F=1774，P>005）中的內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑差異不顯著，發(fā)病植株根（F=21778，P<005）中的內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑顯著大于對照植株。拮抗內生細菌對水稻白葉枯病病菌的影響主要表現在抑菌能力較強的細菌上，且這種影響主要體現在根部。

發(fā)病植株和對照植株的拮抗內生細菌的抑菌圈直徑差異不顯著（F=0148，P>005），其中兩者的根與根（F=2077，P>005）、莖與莖（F=0233，P>005）之間的內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑差異也不顯著，但發(fā)病植株和對照植株的葉與葉（F=8054，P<005）之間的內生細菌對水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異，病株葉部拮抗細菌的抑菌圈直徑顯著高于對照植株。同時，病株的根與莖（F=1040，P>005）、根與葉（F=0270，P>005）、莖與葉（F=2760，P>005）以及對照植株的莖與葉（F=1437，P>005）之間的抑菌圈直徑大小差異均不顯著，但對照植株莖部（F=4604，P<005）和葉部（F=14681，P<005）的內生細菌抑菌圈直徑均顯著高于根部。研究表明，水稻白葉枯病害的發(fā)生提高了水稻根、莖、葉內生細菌的抑菌能力，并且這種改變在水稻的根部最為明顯。

為了測定對水稻白葉枯病病菌抑菌效果較好的拮抗細菌的抑菌譜，采用對峙培養(yǎng)法測定組4中30株菌株對水稻白葉枯病病菌、水稻細菌性條斑病病菌、稻瘟病病菌、水稻紋枯病病菌、水稻惡苗病病菌的拮抗能力。由表3可知，這30株菌株對5種水稻病害的病原菌均有一定的抑制作用，其中對水稻細菌性條斑病病菌的抑菌圈直徑為46～339 mm，對水稻稻瘟病病菌的抑菌圈直徑為69～239 mm，對水稻紋枯病病菌的抑菌圈直徑為46～135 mm，對水稻惡苗病病菌的抑菌圈直徑為41～145 mm。方差分析結果表明，對照植株的內

生細菌對水稻細菌性條斑病病菌（F=9376，P<005）和水稻紋枯病病菌（F=17761，P<005）的抑菌圈直徑均顯著大于發(fā)病植株的內生細菌，而對水稻稻瘟病病菌（F=1256，P>005）和水稻惡苗病病菌（F=0127，P>005）的抑菌圈直徑與發(fā)病植株的內生細菌差異不顯著。endprint

23拮抗內生細菌的鑒定及16S rDNA基因序列分析

將具有拮抗作用的167株內生細菌依據形態(tài)學分為48類內生細菌，選取其中48株代表菌株進行16S rDNA 通用引物27f、1 492 r的PCR擴增，PCR產物由深圳華大基因科技有限公司進行測序。通過16S rDNA序列分析表明，水稻內生細菌分別與GenBank數據庫中17個屬的細菌相似性較高（表4）。因此，167株內生細菌分別屬于17個細菌屬。確定感染白葉枯病病菌的水稻植株與健康水稻植株中內生拮抗細菌屬群菌株數量的比例分布，統(tǒng)計水稻拮抗內生細菌的種群結構。由圖1可知，發(fā)病植株的內生拮抗細菌共包含14個屬，健康植株包含11個屬，其中不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）共9個屬為發(fā)病植株和健康植株所共有，農桿菌屬（Agrobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為發(fā)病植株特有的拮抗細菌屬，而節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和考克斯菌屬（Kocuria）僅存在于健康植株中。發(fā)病植株和健康植株內生拮抗細菌的優(yōu)勢菌屬均為芽孢桿菌屬，且健康植株中芽孢桿菌屬的拮抗細菌所占比例較高。

3結論與討論

本研究結果表明，水稻健康植株和發(fā)病植株的根、莖、葉中均有大量的內生細菌， 其種群數量平均值為 69×105 CFUg，

這與黎起秦等報道的水稻、小麥內生細菌的種群數量17-18]相似，而與Seghers等報道的玉米、甘蔗根部、高梁內生細菌種群數量19-20]存在差異。說明植物內生細菌的種群密度與植物的物種、基因型、植物組織、生長階段和環(huán)境條件等有關21]。水稻不同部位內生細菌的菌株數量存在差異，水稻根部細菌的菌株數量最高，其次是莖、葉。可能是因為水稻的根從土壤中吸收了大量的營養(yǎng)為內生細菌的生長提供了豐富的養(yǎng)分22]。多數植物內生細菌不僅存在于植株體內，也常見于土壤，而水稻內生細菌大多來源于根際土壤，由土壤首先進入植株根中，并在根內定殖，然后在植株體內轉移。

水稻白葉枯病發(fā)生以后，盡管內生細菌的總量沒有發(fā)生改變，但拮抗菌的數量發(fā)生了明顯的變化。病株中拮抗菌的菌株數量明顯增多，主要表現在葉部拮抗菌菌株數量的增多，且抑菌圈直徑與對照植株存在顯著性差異（P<005）。同時，病株和對照植株中拮抗菌的抑菌能力在組4中存在顯著性差異（P<005），并且這種差異主要體現在根部。周崗泉等報道，抗青枯病的番茄品種中內生細菌的含量明顯高于感病品種，番茄青枯病的抗性可能與內生細菌的含量和拮抗菌的數量有關23]。周金鑫等報道，植物與病原菌相互作用的過程中，植物能感受病原菌的入侵并激活多種防御反應24-25]。白葉枯病病菌誘導水稻產生系統(tǒng)抗性，植物體內的生理生化發(fā)生了改變26]，內生細菌與植物在長期的共同進化中形成了一種微妙的協(xié)同關系27-29]，植物對病害產生的應激反應也體現在植物與內生菌組成的微生態(tài)環(huán)境的變化上，導致拮抗菌數量增多，但這種推測有待于進一步研究。

Sun等使用16S rDNA序列分析了2種水稻品種根部內生細菌的多樣性，鑒定出水稻內生細菌有52個操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU），包括寡養(yǎng)單胞菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛生菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬、伯克氏菌屬（Burkholderia）等屬，優(yōu)勢類群為寡養(yǎng)單胞菌屬30]。劉云霞等鑒定出水稻內生細菌的類群有芽孢桿菌屬、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、腸桿菌屬和假單胞菌屬等4個屬，優(yōu)勢屬群為芽孢桿菌屬31]。本研究采用16S rDNA序列鑒定出對水稻白葉枯病病菌具有拮抗作用的內生細菌共包含17個屬，其中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。因此，從水稻內生細菌中篩選具有拮抗作用的芽孢桿菌作為防治水稻病害的生防菌具有廣闊的應用前景，并為水稻白葉枯病的微生態(tài)治理提供了參考。

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