劉猛，樊鳳嬌，石璞潔，涂茂林，于翠平，杜明，，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學化學與化工學院，黑龍江哈爾濱150090；2.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

不同濃度牛乳鐵蛋白對成骨細胞與破骨細胞共培養(yǎng)的影響

劉猛1，樊鳳嬌1，石璞潔1，涂茂林1，于翠平2，杜明1，2，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學化學與化工學院，黑龍江哈爾濱150090；2.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

研究證實牛乳鐵蛋白具有成骨活性功能，既能刺激成骨細胞增殖，也能誘導破骨細胞凋亡。骨骼的生長發(fā)育是一動態(tài)平衡的生物過程，是通過成骨細胞誘導的骨生成和破骨細胞誘導的骨吸收所調節(jié)的。采用成骨細胞MC3T3-E1細胞與破骨前體細胞RAW264.7細胞1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，研究不同濃度（20、100、500μg/mL）的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)中成骨細胞和破骨細胞活性以及破骨細胞骨吸收功能的影響。首先，通過堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒檢測共培養(yǎng)上清中的ALP活性，發(fā)現低濃度的牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細胞的ALP活性，而中高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地促進成骨細胞的ALP活性。利用TRAP活性檢測試劑盒及ELISA檢測試劑盒，則發(fā)現低中濃度的牛乳鐵蛋白能夠促進破骨細胞的TRAP活性，而高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細胞的TRAP活性和共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的比值。最后，通過骨吸收陷窩實驗，證實了中高濃度組的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細胞的骨吸收功能。結果表明了高濃度的牛乳鐵蛋白在共培養(yǎng)體系中不僅能夠促進成骨細胞的活性，并且對破骨細胞具有抑制活性及功能的作用。

牛乳鐵蛋白；成骨細胞；破骨細胞；共培養(yǎng)

乳鐵蛋白的分子量大小約為78 kDa[1-2]，其一級結構組成是由約700個氨基酸組成[3]的單一的多肽鏈結構，并且不同種類的乳鐵蛋白其組成氨基酸序列卻具有極高的同源性。乳鐵蛋白作為一種功能性糖蛋白[4]，具有多種生物學活性，乳鐵蛋白可以促進鐵吸收，具有抗炎[5]和鎮(zhèn)痛的作用[6]，并且在抑菌和調節(jié)機體免疫力等方面也具有生物功能活性。目前已經報道了，牛乳鐵蛋白既能刺激成骨細胞增殖，也能誘導破骨細胞凋亡[7-8]。目前的研究證實了，骨骼的生長發(fā)育是一個動態(tài)平衡的生物過程，主要是通過成骨細胞誘導的骨生成和破骨細胞誘導的骨吸收所共同調節(jié)的[9]。骨組織經歷不斷重塑以確保其結構完整性得到保持，如果這種機制遭到破壞，很有可能產生骨丟失導致如骨質疏松癥和溶骨性疾病等問題[10]。

破骨細胞的分化和骨吸收功能主要是由激素、細胞因子和生長因子直接作用于破骨細胞或間接通過周圍細胞所調控的[11]。其中由成骨細胞產生的細胞因子，包括核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of the NF-κB ligand，RANKL）對于誘導破骨細胞形成，融合，激活和存活至關重要。另一種細胞因子骨保護素（osteoprotegerin，OPG）通過抑制RANKL與其受體核因子κB受體活化因子（receptor activator of the NF-κB，RANK）的結合而作為誘餌受體[12]。所以，RANKL/OPG的比例是起到決定破骨細胞形成和破骨細胞活性的關鍵因素[13-14]。隨著組織工程技術的發(fā)展，并且可以逐漸用于實際應用[15-16]，共培養(yǎng)中使用成骨細胞和破骨細胞傳統上用于確定兩種細胞類型之間的關系[17-18]。鑒于牛乳鐵蛋白的成骨活性功能，我們有興趣知道它在骨重塑中發(fā)揮的作用，特別是在破骨細胞吸收活動中，在這項研究中，我們調查牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)中成骨細胞和破骨細胞活性以及破骨細胞骨吸收功能的影響。目前已經報道了可以采用直接將成骨細胞與破骨前體細胞共培養(yǎng)的方式，通過成骨細胞所分泌的細胞因子來促進破骨細胞的分化形成，從而獲得成骨細胞和破骨細胞的共培養(yǎng)體系[19-20]。因此，本研究采用了將種屬來源一致的成骨細胞MC3T3-E1細胞與破骨前體細胞RAW264.7細胞以1∶1的比例進行共培養(yǎng)，同時添加能夠支持成骨細胞和破骨細胞共同生長的培養(yǎng)基[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛乳鐵蛋白（＞94%）、TRAP染色試劑盒、Corning Osteo Assay surface 24孔人工骨板：美國Sigma公司；α-MEM、胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.02%）消化液、青霉素鏈霉素混合抗生素溶液：美國Hyclone公司；胎牛血清、D-MEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司。

倒置式生物顯微鏡：日本Nikon公司；Zeiss Axiovert 200顯微鏡：德國Zeiss公司；Eon型酶標儀：美國BioTek公司；HEPA class 100型細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

對于成骨細胞，在含有1%抗生素（10 mg/mL鏈霉素B和10 000 U/mL青霉素G）和10%胎牛血清的α-MEM中培養(yǎng)來源于新生小鼠顱骨的MC3T3-E1細胞。對于破骨前體細胞，將RAW264.7細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中（含有10%胎牛血清，10 mg/mL鏈霉素和10 000 U/mL青霉素）。在37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液在匯合前每隔一天更換一次，使用胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.02%）消化液傳代細胞。成骨細胞：破骨前體細胞以1∶1細胞（MC3T3-E1細胞：RAW264.7細胞）的比例共培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組

樣品分組：樣品分3組，分別為牛乳鐵蛋白低質量濃度組（20 μg/mL）、牛乳鐵蛋白中質量濃度組（100 μg/mL）和牛乳鐵蛋白高質量濃度組（500 μg/mL）。

1.2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色觀察破骨細胞

調整MC3T3-E1細胞和RAW264.7細胞濃度以1×104個/孔接種到預先放置有無菌細胞爬片的六孔板中，每孔各加入1 mL細胞懸液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，并添加新鮮培養(yǎng)基，每2天更換新鮮培養(yǎng)基1次。共培養(yǎng) 5、7、9、11、13、15 天后，取出細胞爬片后，按照試劑盒說明書固定細胞后進行TRAP染色，并將TRAP陽性多核細胞（3個或3個以上）計數為破骨細胞，使用Zeiss Axiovert 200顯微鏡觀察并拍攝顯微照片[23]。

1.2.4 TRAP活性檢測

按照1.2.3中方法共培養(yǎng)，每2天更換新鮮培養(yǎng)基一次并添加不同濃度的牛乳鐵蛋白，選擇共培養(yǎng)11天后，收集細胞培養(yǎng)液上清，1 000 r/min離心10 min去除細胞沉淀后，進行TRAP活性檢測。按照TRAP活性試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37℃下孵育30 min，取出加入終止液終止其反應，置于405 nm處測定其吸光度[24]。

1.2.5 堿性性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性檢測

按照1.2.4中方法獲得培養(yǎng)基上清，進行ALP活性檢測。按照ALP活性試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37℃下孵育30 min，取出加入終止液終止其反應，置于405 nm處測定其吸光度[24]。

1.2.6 骨吸收實驗

調整MC3T3-E1細胞和RAW264.7細胞濃度各以500個/孔接種到Corning Osteo Assay surface 24孔人工骨板上，兩種細胞每孔各加入0.5 mL細胞懸液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，并添加新鮮培養(yǎng)基及不同濃度的牛乳鐵蛋白，每3天更換新鮮培養(yǎng)基一次同時補加不同濃度的牛乳鐵蛋白樣品。選擇培養(yǎng)11天后，用5%的次氯酸鹽溶液將細胞從人工骨板的底部洗掉，蒸餾水清洗2次，待骨板干燥后，使用Zeiss Axiovert 200顯微鏡拍攝，利用Image J軟件計算吸收面積的百分比[25]。

1.2.7 ELISA法檢測RANKL/OPG

按照1.2.4中方法獲得培養(yǎng)基上清，采用ELISA法分別測定RANKL與OPG的含量，按照試劑盒說明書操作進行，然后計算RANKL/OPG的比值[26]。

1.2.8 統計學及繪圖

數據采用Origin 8.0軟件進行計算繪圖。采用SPSS 17.0統計軟件，one-way ANOVA進行顯著性檢驗。數據以±s表示，p＜0.05為顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 共培養(yǎng)體系在倒置顯微鏡下的觀察結果

本試驗采用成骨細胞MC3T3-E1細胞與破骨前體細胞RAW264.7細胞1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，如圖1所示。

圖1 共培養(yǎng)體系在倒置顯微鏡下的觀察結果Fig.1 Observation of phase contrast microscope for co-cultured system

顯微鏡下觀察貼壁生長的細胞，共培養(yǎng)1天后，MC3T3-E1細胞形成單層覆蓋，形狀多為長梭形和三角形，并且有2～3個突起，細胞質飽滿，清晰透亮；RAW264.7細胞則多為單個核細胞，形狀多為圓形和橢圓形。共培養(yǎng)5天后，發(fā)現細胞已經在細胞培養(yǎng)瓶中鋪滿了整個底面，兩種細胞分層明顯，破骨細胞數量少于成骨細胞，并且位于成骨細胞之上，體積跟剛貼壁時相比明顯增大；部分的成骨細胞有3～4個突起，并且相互連接匯合，結構似星形，顯示出較好的貼壁性；可以觀察到單核細胞開始融合的現象，并且可見臘腸型等形態(tài)不規(guī)則破骨細胞形成，并且有偽足伸出，出現了多個體積較大的多核細胞。而且隨著共培養(yǎng)時間的增加，破骨細胞的數量逐漸增多，并且細胞直徑也逐漸增大。但是，在共培養(yǎng)時間達到15天后，出現了衰退的跡象。

2.2 TRAP染色觀察與破骨細胞計數

共培養(yǎng)細胞進行TRAP染色后，于顯微鏡下觀察分析破骨細胞并且計數，結果如圖2與圖3所示。

共培養(yǎng)5天可見TRAP陽性細胞形成，顯微鏡下可以觀察到見大量染為淺色的成骨細胞，而破骨細胞數量極少且細胞質呈現深色。共培養(yǎng)9天后，RAW264.7細胞的體積逐漸變大，并且有偽足伸出，出現了多個體積較大的多核細胞（3個或3個以上），TRAP活性部位表現出深色顆粒（TRAP陽性的特征）變得明顯。隨著共培養(yǎng)時間的增加，TRAP陽性多核細胞數目和細胞核數目逐漸增加，并且細胞直徑也有所增加。共培養(yǎng)15天后，破骨細胞數量有減少趨勢，細胞邊緣變得模糊不清，部分細胞更是表現出了崩解的現象。

圖2 共培養(yǎng)體系的TRAP染色Fig.2 TRAP staining for co-cultured system

圖3 共培養(yǎng)體系的TRAP陽性細胞計數Fig.3 TRAP-positive large multinucleated cells counting for cocultured system

2.3 不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中破骨細胞活性的影響

當在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時，選擇共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現了共培養(yǎng)體系中破骨細胞的TRAP活性與空白組相比，表現出先升高后降低的趨勢。20 μg/mL和100 μg/mL組分別升高至對照組的約187.8%和168.9%，而500 μg/mL組則降低至至對照組的約25.6%，如圖4所示。

圖4 牛乳鐵蛋白對破骨細胞活性的影響Fig.4 Effects of bovine lactoferrin on TRAP activity of osteoclast for co-cultured system

在共培養(yǎng)體系里，破骨細胞形成的過程中，主要是由成骨細胞提供RANKL給破骨細胞前體，這些結果說明了在低濃度的牛乳鐵蛋白存在時，來自成骨細胞的RANKL對TRAP活性的貢獻是相當大的，表現在破骨細胞的TRAP與空白組相比顯著升高，另外又由于牛乳鐵蛋白能夠抑制破骨細胞的形成，所以造成了隨著牛乳鐵蛋白的濃度的升高，共培養(yǎng)體系中破骨細胞的TRAP活性逐漸降低，而在500 μg/mL時，牛乳鐵蛋白的作用超過了RANKL，導致破骨細胞的TRAP與空白組相比顯著降低。

2.4 不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中成骨細胞活性的影響

當在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時，選擇共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現了成骨細胞的TRAP活性與空白組相比，表現出先降低后升高的趨勢，其中100 μg/mL牛乳鐵蛋白組表現出最強的促進作用。100 μg/mL和500 μg/mL組分別升高至對照組的約145.3%和101.1%，而20 μg/mL組則降低至至對照組的約69.4%，如圖5所示。

圖5 牛乳鐵蛋白對成骨細胞活性的影響Fig.5 Effects of bovine lactoferrin on ALP activity of osteoblasts for co-cultured system

這些結果說明了在低濃度的牛乳鐵蛋白存在時，由于成骨細胞分泌的RANKL能夠促進破骨細胞的形成，而牛乳鐵蛋白又能夠抑制破骨細胞的形成，為了平衡這種作用，表現出了與空白組抑制了成骨細胞的活性。而隨著牛乳鐵蛋白的濃度的升高，破骨細胞的TRAP活性逐漸降低，牛乳鐵蛋白促對成骨細胞的促進作用又占了主導作用，表現在提高了ALP的活性，并且100 μg/mL的牛乳鐵蛋白組對于成骨細胞的活性具有最高的促進作用。

2.5 牛乳鐵蛋白對成骨細胞：破骨細胞共培養(yǎng)骨吸收的影響

采用將MC3T3-E1細胞與胞RAW264.7細胞以1∶1的比例直接接觸的方式直接接種到人工骨板上進行共培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時，選擇共培養(yǎng) 11 天后，測定不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中破骨細胞的骨吸收功能。人工骨板被破骨細胞吸收后會形成骨吸收陷窩，而顏色深的區(qū)域則表示未被破骨細胞吸收，如圖6所示。

圖6 乳鐵蛋白對破骨細胞骨吸收的影響Fig.6 Effects of bovine lactoferrin on bone resorption of osteoclasts for co-cultured system

經過不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）處理后，與空白組相比，骨吸收凹陷部位面積表現出先升高后降低的趨勢，而且500 μg/mL組存在較多顏色較淺的骨吸收區(qū)域，是由于少量功能不佳的破骨細胞產生的。通過定量分析結果表明，濃度為20、100、500 μg/mL的牛乳鐵蛋白與對照組相比的百分比，分別約為111.2%、66.9%、45.1%，這些數據表明了中高濃度的牛乳鐵蛋白均對共培養(yǎng)體系中破骨細胞的功能也有一定的抑制作用。

2.6 牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的影響

當在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時，共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現了共培養(yǎng)體系中RANKL/OPG與空白組相比，表現出先升高后降低的趨勢。20 μg/mL和100 μg/mL組分別升高至對照組的約105.5%和102.6%，而500 μg/mL組則降低至至對照組的約87.0%，如圖7所示。

圖7 乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的影響Fig.7 Effects of bovine lactoferrin on RANKL/OPG for cocultured system

由于已經證實了牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細胞的RANKL mRNA的表達，并促進OPG mRNA的表達，從而降低RANKL/OPG的比值。這些結果說明了在共培養(yǎng)體系中，低中濃度組的牛乳鐵蛋白沒有降低RANKL/OPG的比值，而高濃度組的牛乳鐵蛋白則能夠顯著降低RANKL/OPG的比值，從而降低共培養(yǎng)體系中破骨細胞的形成和活性，影響了骨的吸收。

3 結論

本試驗通過采用種屬來源一致的成骨細胞MC3T3-E1細胞與破骨前體細胞RAW264.7細胞以1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，研究了濃度為20、100、500 μg/mL的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中成骨細胞與破骨細胞活性以及破骨細胞骨吸收功能的影響。對于成骨細胞，發(fā)現了低濃度的牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細胞的ALP活性，而中高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地促進成骨細胞的ALP活性。對于破骨細胞，則發(fā)現了低中濃度的牛乳鐵蛋白能夠促進破骨細胞的TRAP活性，而高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細胞的TRAP活性和RANKL/OPG的比值。另外中高濃度組的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細胞的骨吸收功能。綜上所述，我們證明了高濃度的牛乳鐵蛋白在共培養(yǎng)體系中不僅能夠促進成骨細胞的活性，并且對破骨細胞具有抑制活性及功能的作用，這對于牛乳鐵蛋白應用到骨代謝疾病及骨組織工程領域奠定了理論基礎。

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Effects of Different Concentrations of Bovine Lactoferrin on Osteoblast/Osteoclast Co-cultures

LIU Meng1，FAN Feng-jiao1，SHI Pu-jie1，TU Mao-lin1，YU Cui-ping2，DU Ming1，2，*
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

The osteogenic activity of bovine lactoferrin has been proved that bovine lactoferrin could promote proliferation and differentiation of osteoblasts and inhibit apoptosis of osteoclast.The growth and development of bones depended on the balance between bone resorption and bone formation.Osteoblasts and osteoclasts were associated with bone formation and bone resorption，respectively.The effects of different concentrations of bovine lactoferrin （20，100，500 μg/mL）on the osteoblast and osteoclast activity and bone resorptive activity of osteoclast were studied by co-cultures of MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells （used at a ratio of 1：1）in this paper.Alkaline Phosphatase（ALP）activity was detected by ALP activity Assay Kit.The result showed that low concentrations of bovine lactoferrin inhibited ALP activity of osteoblasts，whereas middle and high concentrations of bovine lactoferrin could significantly promote ALP activity.By tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）activity Assay Kit and the ELISA kits，it was found that low and middle concentration of bovine lactoferrin could promote the TRAP activity of osteoclasts，while high concentrations of bovine lactoferrin could sig nificantly inhibit the TRAP activity and the ratio of receptor activator of the NF-κB ligand （RANKL）and os－teoprotegerin（OPG）.Bone resorptive activity of osteoclast as evaluated on bone-mimetic plates was significantly inhibited by middle and high concentration of bovine lactoferrin.In general，these results indicated that high concentrations of bovine lactoferrin could not only promote osteoblasts activity，but also inhibit steoclasts activity and function in co-culture system.

bovine lactoferrin；osteoblast；osteoclasts；co-culture

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.001

國家自然科學基金資助項目（31371805、31101316）

劉猛（1988—），男（漢），博士研究生，研究方向：食品科學。

*通信作者：杜明（1977—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品科學。

2017-10-23