姜世勃 蘇 珊 夏 帥 鄒 鵬 陸 路

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系,復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

專家簡(jiǎn)介姜世勃,教授,博導(dǎo),國(guó)家 “千人計(jì)劃” 特聘專家,復(fù)旦大學(xué)病原微生物研究所所長(zhǎng)。畢業(yè)于第一和第四軍醫(yī)大學(xué)并獲得碩士和博士學(xué)位,1987—1990年在美國(guó)紐約洛克菲勒大學(xué)進(jìn)修學(xué)習(xí)和博士后訓(xùn)練,1990—2010年在紐約血液中心LFK研究所先后擔(dān)任助理研究員、副研究員、研究員和研究室主任。曾是武漢大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、廣州第一軍醫(yī)大學(xué)、西安第四軍醫(yī)大學(xué)、中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院客座教授,中國(guó)科學(xué)院海外評(píng)審專家、清華大學(xué)高級(jí)訪問(wèn)學(xué)者、上海計(jì)劃生育研究所特聘顧問(wèn)、南方醫(yī)科大學(xué)抗病毒中心榮譽(yù)主任和特聘教授。2010年10月入選國(guó)家 “千人計(jì)劃” ,回國(guó)擔(dān)任復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授。

從事抗病毒 (HIV、SARS-CoV、MERS-CoV、RSV、HPV、流感病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒等) 藥物及疫苗研究多年,是國(guó)際上最早參與研發(fā)預(yù)防HIV性傳播“殺微生物劑”的研究人員之一。20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)抗HIV的C-多肽,發(fā)明專利轉(zhuǎn)讓給美國(guó)Trimeris和羅氏制藥公司,用于開(kāi)發(fā)國(guó)際上第一個(gè)抗HIV多肽藥物——恩夫韋肽 (Enfuvirtide,又名T20)。該發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了研發(fā)病毒融合/入侵抑制劑和抗病毒多肽藥物的全新領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上,帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)又先后發(fā)現(xiàn)了抗SARS-CoV、MERS-CoV和寨卡病毒的多肽,并研發(fā)出最為安全、有效的SARS和MERS候選亞單位疫苗。最近,又在中國(guó)成功開(kāi)發(fā)上市一個(gè)可防控HPV感染、降低宮頸癌發(fā)生率的JB01生物蛋白,現(xiàn)已在全國(guó)500多家三甲醫(yī)院使用,年銷售量2～3億元人民幣。

已發(fā)表385篇SCI論文和117篇非SCI論文,累計(jì)影響因子1 881 (篇均4.9),其中包括Nature、NatMed、NatCommun、NatRevMicrobiol、Lancet、Cell、JExpMed、ProcNatlAcadSciUSA等,被引用11 000多次,h指數(shù)57。已申請(qǐng)美國(guó)專利32項(xiàng) (授權(quán)21項(xiàng)) 和中國(guó)及PCT專利37項(xiàng) (授權(quán)7項(xiàng)),作為PI獲得美國(guó)NIH研究基金項(xiàng)目9項(xiàng)2 000多萬(wàn)美元、中國(guó)國(guó)家和省部級(jí)研究基金項(xiàng)目9項(xiàng)2 000多萬(wàn)元人民幣,在30多個(gè)國(guó)家作學(xué)術(shù)報(bào)告200多場(chǎng)。

國(guó)際抗病毒研究學(xué)會(huì)、國(guó)際艾滋病學(xué)會(huì)、美國(guó)微生物學(xué)會(huì)、美洲華人生物科學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)員,國(guó)際頂尖醫(yī)學(xué)雜志TheLancet編輯顧問(wèn) (editorial consultant),PLoSOne科學(xué)編輯,EmergMicrobInfect、Retrovirology、PLoSOne、BiochimBiophysActa、MicrobInfect雜志編委,為60多家英文雜志 (如Science、SciTransMed、NatMed、Lancet等) 審稿,美國(guó)健康研究院 (NIH)、香港研究資助局 (RGC)、中國(guó)自然科學(xué)基金會(huì) (NSFC)、加拿大健康研究院 (CIHR)、新加坡科學(xué)技術(shù)研究局 (A*STAR) 評(píng)審委員。

上海醫(yī)學(xué)院創(chuàng)建90周年寄語(yǔ)先驅(qū)湯飛凡,后任林飛卿;勇者聞?dòng)衩?滅毒為人民;主任袁正宏,帶隊(duì)向前進(jìn);分子病毒室,日漸更興盛;本人受感召,歸國(guó)為使命;入侵抑制劑,突破加創(chuàng)新;御敵國(guó)門外,抗擊傳染病。

“御敵于國(guó)門之外”
——病毒入侵抑制劑的研究進(jìn)展

姜世勃△蘇 珊 夏 帥 鄒 鵬 陸 路

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系,復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032)

25年前,我們?cè)趪?guó)際上開(kāi)辟了研發(fā)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)融合/入侵抑制劑和抗HIV多肽藥物的全新領(lǐng)域。近6年來(lái),我們?cè)贖IV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)入侵抑制劑的研發(fā)工作中取得了一系列重要研究成果。本文概要性地綜述了相關(guān)高致病性病毒入侵抑制劑的研究進(jìn)展。

高致病性病毒; 病毒入侵抑制劑; 病毒滅活劑

病毒是一類只能在有機(jī)體活細(xì)胞內(nèi)完成自身復(fù)制的病原微生物。由于病毒不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),無(wú)法通過(guò)自體的分裂來(lái)完成自身增殖,所以其只能寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)來(lái)完成自身的擴(kuò)增。所以病毒的完整生命周期包括進(jìn)入宿主細(xì)胞并完成復(fù)制的整個(gè)過(guò)程,大致分為如下步驟:附著 → 入侵 → 脫殼 → 合成 → 組裝 →釋放。

現(xiàn)有的主要抗病毒藥物作用在病毒生命周期的各個(gè)階段。其中,入侵抑制劑作用在較早的病毒黏附及入侵階段,也稱為進(jìn)入抑制劑(entry inhibitor)。病毒通過(guò)特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的受體附著到宿主細(xì)胞表面,然后通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞或者膜融合途徑進(jìn)入靶細(xì)胞(圖1)。相應(yīng)的,入侵抑制劑主要分為黏附抑制劑(attachment inhibitors),受體/共受體拮抗劑(receptor/coreceptor antagonists),融合抑制劑(fusion inhibitors)和病毒滅活劑(virus inactivators),分別阻斷病毒與宿主靶細(xì)胞的黏附,與受體/共受體的結(jié)合,與靶細(xì)胞膜融合,及在細(xì)胞外滅活病毒。病毒除了通過(guò)靶細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,也能通過(guò)感染細(xì)胞傳遞到相鄰的未感染細(xì)胞,該途徑同樣由病毒包膜蛋白介導(dǎo),所以入侵抑制劑也能阻斷這一傳播途徑,在這個(gè)方面相較于其他抗病毒藥物有明顯優(yōu)勢(shì)。入侵抑制劑包括多肽,抗體,修飾蛋白及化學(xué)小分子,各有其優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。

A:Virus enters the target cell by receptor-mediated endosomal membrane fusion;B:Virus enters target cell by receptor-mediated plasma membrane fusion.

圖1病毒進(jìn)入靶細(xì)胞過(guò)程
Fig1Entryprocessofavirus

與其他入侵抑制劑的作用機(jī)制不同,病毒滅活劑可直接作用于人體內(nèi)游離的病毒顆粒,使病毒包膜蛋白發(fā)生構(gòu)象變化,使得病毒喪失感染靶細(xì)胞的能力;或者直接破壞病毒膜的完整性,導(dǎo)致病毒基因組釋放,失去活性。

由于病毒滅活劑能直接地滅活游離病毒顆粒,而其他入侵抑制劑能阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞,它們均能保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染。其相較于其他必須進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)抑制病毒復(fù)制的抗病毒藥物而言,能更好地保護(hù)宿主細(xì)胞的功能以及活性,避免病毒進(jìn)入細(xì)胞后整合到人類基因組,并減少對(duì)細(xì)胞的毒性作用。所以,如果能夠開(kāi)發(fā)出抗病毒活性強(qiáng),成藥性好的病毒入侵抑制劑,將能夠更有效地防控病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染,真正做到“拒敵于國(guó)門之外”。

人類免疫缺陷病毒(HIV)入侵抑制劑和滅活劑人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是包含兩條相同正鏈RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒,通過(guò)其包膜蛋白介導(dǎo)的膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。該過(guò)程中,HIV包膜蛋白亞單位gp120首先與靶細(xì)胞上的受體及共受體反應(yīng),導(dǎo)致 gp41亞單位暴露。暴露后的gp41 N末端的融合多肽(FP)插入靶細(xì)胞膜,其N端七重復(fù)螺旋序列(N-terminal heptad repeats,NHR)和C端七重復(fù)螺旋序列(C-terminal heptad repeats,CHR)相互反應(yīng),形成發(fā)夾樣六聚體結(jié)構(gòu)(six helix bundle,6-HB)[1],拉近病毒與靶細(xì)胞發(fā)生膜融合。HIV入侵抑制劑即作用在這個(gè)階段,現(xiàn)在美國(guó)食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)上市的HIV入侵抑制劑包括融合抑制劑——恩夫韋肽(enfuvirtide,又叫T20)和CCR5拮抗劑——馬拉維若(maroviroc)。其中,T20能與gp41的NHR區(qū)結(jié)合,阻斷6-HB的形成,抑制HIV與靶細(xì)胞的膜融合進(jìn)程(圖2)。

Binding of the HIV-1 gp120 to the receptor and co-receptor triggers the exposure of gp41.An HIV-1 fusion inhibitor can binds to the exposed gp41 to block the 6-HB formation,thus inhibiting HIV-1 entry into the target cell.

圖2HIV-1融合抑制劑作用機(jī)制
Fig2MechanismofactionofHIVfusioninhibitors

多肽類藥物 1990年初,姜世勃及同事在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)來(lái)源于HIV-1 gp41蛋白CHR結(jié)構(gòu)域的多肽(C-多肽)-- SJ-2176能有效抑制HIV感染[2-3],其發(fā)明專利(USP5,444,044)轉(zhuǎn)讓給美國(guó)Trimeris藥物公司,該公司與羅氏制藥公司合作,開(kāi)發(fā)出國(guó)際上第一個(gè)能抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的多肽藥物T20。該藥物被譽(yù)為是艾滋病藥物研究史上的一個(gè)里程碑,其出現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)了國(guó)際病毒入侵抑制劑和抗病毒多肽藥物的新領(lǐng)域。T20在臨床治療上表現(xiàn)出了較好的效果,特別是對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抗性的艾滋病患者,具有顯著的療效。但由于T20半衰期較短,活性較低,需每日皮下注射兩次,導(dǎo)致注射局部反應(yīng)重及費(fèi)用高。而且,T20在臨床使用久了以后易誘導(dǎo)HIV耐藥毒株的產(chǎn)生。因此,對(duì)T20藥物的改造及新型同類藥物的設(shè)計(jì)成為該領(lǐng)域研究的主要方向。我們團(tuán)隊(duì)在該方面也做了大量的工作,發(fā)現(xiàn)了多種更高效和更長(zhǎng)效的多肽類HIV入侵抑制劑。

首先,為了改造T20,使其活性提升,我們對(duì)T20的作用機(jī)制開(kāi)展了更深入的研究。我們發(fā)現(xiàn)T20與大部分C多肽不同,它需要借助脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(lipid binding domain,LBD)與細(xì)胞膜作用后才能有效結(jié)合到gp41的NHR區(qū),進(jìn)而阻斷6-HB形成和抑制病毒與細(xì)胞膜的融合[4]。而其他C-多肽(如C34)不含有LBD,但含有可與NHR上的口袋形成區(qū)(pocket forming domain,PFD)密切結(jié)合的口袋結(jié)合區(qū)(pocket binding domain,PBD),所以這些C-多肽可以直接與NHR結(jié)合形成更穩(wěn)定的6-HB,更有效地阻止病毒6-HB的形成,從而擁有比T20更好的抑制活性[5]。因此,我們將注意力更加聚焦于包含有PBD的C-多肽的研究上。

基于C34序列,引入更多帶電荷的氨基酸殘基來(lái)穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)出的西夫韋肽(Sifuvirtide)比T20具有更強(qiáng)的抗抗HIV活性,且對(duì)T20抗性株也有顯著的抑制效果[6]。該藥物目前已在國(guó)內(nèi)通過(guò)了臨床I期和II期試驗(yàn)。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)包含了C34上游(621-627:QIWNNMT)序列的CP621-652多肽擁有更好的抗HIV感染的活性[7]。進(jìn)一步引入增加其α螺旋性的E-K鹽橋突變后,得到的CP32M多肽具有低納摩爾級(jí)別的抑制HIV融合和進(jìn)入靶細(xì)胞的活性[8]。

進(jìn)一步分析QIWNNMT序列與NHR的反應(yīng),何玉先等發(fā)現(xiàn)(626)MT(627)序列能形成鉤狀結(jié)構(gòu),將該M-T鉤子加到C-多肽的N末端后,可有效地提高這些C-多肽的HIV抑制活性[9-10]。最近,我們?cè)O(shè)計(jì)了基于IDL序列的另一類鉤狀結(jié)構(gòu),將其加到C-多肽的C末端后也能顯著提升C-多肽的抑制活性。同時(shí)將M-T鉤子和IDL鉤子分別加到一個(gè)C多肽N和C末端,可以更顯著提升該C多肽的抗HIV-1活性,對(duì)一些HIV-1臨床株的半數(shù)抑制濃度(IC50)能達(dá)到0.1納摩爾[11]。

此外,我們還對(duì)多肽的設(shè)計(jì)模型進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)以往對(duì)于C-多肽上的點(diǎn)突變位點(diǎn)選擇均是基于6-HB經(jīng)典螺旋模型,但是該模型沒(méi)有考慮氫鍵、鹽橋和氨基酸側(cè)鏈的作用,有一定的局限性。所以,我們利用已解析的多個(gè)6-HB晶體結(jié)構(gòu)分析了CHR上每個(gè)殘基對(duì)于結(jié)合NHR的作用,提出了NHR-CHR-NHR新模型,將參與螺旋模型形成的氨基酸殘基從29%提高到76%,使設(shè)計(jì)突變的選擇范圍大大提高,同時(shí)基于新模型設(shè)計(jì)的C34突變體多肽也較C34有更好的抗HIV-1活性[12]。

同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),截至目前大部分C-多肽的設(shè)計(jì)均是基于CHR的天然序列,所以部分HIV感染者體內(nèi)預(yù)先存在的靶向CHR的抗體將拮抗C-多肽的抗HIV-1活性。因此,我們基于人工多肽模板5HRu,結(jié)合MT序列設(shè)計(jì)了多肽AP1、AP2和AP3。其中AP3效果最好,較T20半衰期更長(zhǎng),且血清中預(yù)存的抗HIV-1抗體不但沒(méi)有削弱其活性,反而增強(qiáng)了其抗病毒的效果[13]。我們的研究還證明將膽固醇分子連接到人工多肽的N-末端可明顯提高該人工多肽的抗病毒活性[14]。

除了以上手段,還有研究者使用了非天然氨基酸[15-16]、酯化肽[14,17-18]以及氨基酸定點(diǎn)共價(jià)交聯(lián)[19]等手段來(lái)提升C-多肽的性能(表1),并獲得了多種高活性或具有顯著優(yōu)勢(shì)的C-多肽抑制劑。

在聯(lián)用策略方面,我們還發(fā)現(xiàn)雖然C-多肽均靶向gp41 NHR,但第一代融合抑制劑T20和第二代融合抑制劑T1144或者西夫韋肽聯(lián)合使用時(shí),均具有很好的協(xié)同作用效果,且對(duì)T20耐受株也有效。這一研究成果也為臨床聯(lián)合使用不同的HIV融合抑制劑提供了依據(jù)[20]。

除了C-多肽的研究,我們也開(kāi)展了來(lái)源于gp41 NHR區(qū)的N-多肽的研究工作。目前,學(xué)界大多數(shù)研究都集中于來(lái)源于gp41 CHR區(qū)的C-多肽,因?yàn)镹HR來(lái)源的序列疏水性強(qiáng),在中性溶液中極易發(fā)生聚集沉降,大大影響了其抑制活性。我們利用T4 fibritin三聚域(Fd)構(gòu)建了NHR三聚體,大大提高了N-多肽的水溶性和抗HIV-1活性[21],為設(shè)計(jì)基于N-多肽的抗HIV藥物提供了新的思路。

小分子類藥物 相較于多肽類藥物,小分子藥物成本低,且可以口服,因此也成為入侵抑制劑設(shè)計(jì)的重要方向之一。本團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了ADS-J1對(duì)HIV-1有低毫摩爾級(jí)別的抑制作用[22],并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)其可阻斷6-HB的形成和HIV-1包膜蛋白Env介導(dǎo)的膜融合,證明了研發(fā)小分子類入侵抑制劑的可能。

表1 多肽類HIV入侵抑制劑的修飾策略Tab 1 Strategies to optimize the peptide-based HIV entry inhibitors

本團(tuán)隊(duì)還利用在之前研究所發(fā)現(xiàn)的能特異性識(shí)別6-HB結(jié)構(gòu)的單克隆抗體-NC-1,建立起了可高通量篩選具有阻斷6-HB形成活性的HIV入侵抑制劑篩選模型,并利用該模型篩選了大量的小分子入侵抑制劑。其中包括NB-2和NB-64[23-24],它們可結(jié)合到NHR的疏水溝槽中,對(duì)各型HIV均有較好的抑制作用。進(jìn)一步優(yōu)化NB-64得到了A12,GLS-22,GLS-23,NB-206以及NB206的衍生物11b,11d,11a,121,12m,5f和5g[25-26]等,其中一些抗HIV-1活性得以顯著提升,具有開(kāi)發(fā)成為藥物的潛力。并且,為了得到活性和耐受性都更好的藥物,我們還設(shè)計(jì)了多肽與小分子化合物相結(jié)合的新型藥物。我們將人工設(shè)計(jì)的四重復(fù)多肽-m4HR與小分子pssm結(jié)合,得到了具有低毫摩爾級(jí)別抗HIV-1活性的新型融合抑制劑[14],其在入侵抑制劑的設(shè)計(jì)和作用機(jī)制研究上具有重要意義。

HIV滅活劑 現(xiàn)有的抗HIV臨床藥物均是作用于HIV附著到靶細(xì)胞表面或者是進(jìn)入HIV后各個(gè)階段的,均不能在沒(méi)有靶細(xì)胞存在的情況下,直接滅活游離HIV的病毒顆粒,使其失去感染活性。可溶性CD4(sCD4)在體外實(shí)驗(yàn)中顯示在較高濃度的情況下,具有一定滅活HIV病毒的能力,但體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其在較低濃度下還會(huì)促進(jìn)一些HIV-1亞型的感染,因此sCD4較難作為HIV滅活劑來(lái)進(jìn)行開(kāi)發(fā)。在仔細(xì)分析了sCD4的作用機(jī)制后,我們以創(chuàng)新的思路構(gòu)建了一個(gè)新型的HIV滅活劑,將CD4的D1D2結(jié)構(gòu)域和T1144多肽串聯(lián)在一起,命名為2DLT[27]。D1D2結(jié)構(gòu)域結(jié)合gp120上的CD4結(jié)構(gòu)區(qū)后,T1144能緊接著結(jié)合到D1D2所誘導(dǎo)的gp41融合中間態(tài)上的NHR區(qū),從而使HIV-1 Env發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的構(gòu)象變化,成為融合后構(gòu)象,使HIV病毒顆粒喪失了感染力,并且還解除了sCD4促進(jìn)HIV感染的作用(圖3)。通過(guò)進(jìn)一步的研究,我們還發(fā)現(xiàn),2DLT不但單獨(dú)使用就有較高的抑制活性,而且其與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑以及非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)合使用還具有顯著的協(xié)同效應(yīng)[28],有潛力加入到“高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)”中,來(lái)提升各類藥物的抗病毒活性及抗變異。我們最近的研究證明將C-多肽(如T20,T1144,或SFT)與作用于gp120的雙特異性抗體復(fù)合物——4Dm2m 合用可大大提高4Dm2m對(duì)HIV-1的滅活作用[29]。

A:T1144 alone can bind to gp41 after gp120 interacts with the receptor and co-receptor,thus blocking the membrane fusion process;B:2D in 2DLT binds to HIV-1 gp120,triggering the exposure of gp41.T1144 in 2DLT then interacts with gp41,resulting in the inactivation of the virion.

圖3HIV-1滅活劑2DLT作用機(jī)制示意圖
Fig3MechanismofactionofHIVinactivator-2DLT

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)入侵抑制劑冠狀病毒是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒。其中,SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是感染人類并對(duì)人高致病性的冠狀病毒,對(duì)人類的生命健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。冠狀病毒的感染機(jī)制與HIV-1類似,其包膜蛋白(S蛋白)在介導(dǎo)感染的過(guò)程發(fā)揮著重要作用[30-31]。近年來(lái),本團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的靶向于S蛋白的多肽和抗體可有效抑制病毒的進(jìn)入,具有很好的抗病毒效果。

2002年,SARS-CoV于廣州首次爆發(fā),導(dǎo)致8 000多人的感染,并具有近10%的死亡率[31]。在SARS-CoV疫情的傳播過(guò)程中,果子貍是其中間宿主,而菊頭蝙蝠是其原始宿主。SARS-CoV可從果子貍等中間宿主直接傳播到人類,但是否存在由蝙蝠直接傳播到人類的可能還不是很清楚[32](圖4)。在抗SARS-CoV的入侵抑制劑研究方面,本團(tuán)隊(duì)于2004年成功地分析出SARS-CoV S蛋白中七肽重復(fù)區(qū)域的具體特征,發(fā)現(xiàn)分別源自于HR1和HR2的多肽CP-1和NP-1,相互作用下可形成六螺旋結(jié)構(gòu),并且多肽CP-1可有效地抑制SARS-CoV的融合進(jìn)入過(guò)程,具有很好的抗SARS-CoV活性[33]。在針對(duì)S蛋白抗體類入侵抑制劑的研發(fā)方面,也取得了顯著的進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)源自于S蛋白受體結(jié)合域(receptor-binding domain,RBD)的重組蛋白,在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體,我們從中分離出27株鼠源單克隆抗體,其中25株能識(shí)別SARS-CoV RBD中不同空間構(gòu)型中和表位的單抗具有很好的廣譜SARS-CoV中和活性[34]。同樣,Dimitrov等與我們合作在抗體庫(kù)中篩選出針對(duì)于SARS-CoV RBD的全人源單克隆抗體m396,具有高效并且廣譜的中和活性[35]。這些單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了抗SARS-CoV 的入侵抑制劑種類[31]。

中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)入侵抑制劑2012年,中東地區(qū)首次爆發(fā)了新型人感染冠狀病毒MERS-CoV。流行病學(xué)表明,蝙蝠是其自然宿主,而單峰駱駝(dromedary)則可能是其中間宿主。目前已有直接證據(jù)證明MERS-CoV的“駱駝-人”的傳播途徑,但是否存在“蝙蝠-人”的直接傳播途徑,還有待進(jìn)一步研究(圖5)[32]。

The horseshoe bat is the natural reservoir of SARS-CoV,while the palm civet is its intermediate reservoir.The civet-to-human transmission of SARS-CoV has been confirmed,but it is still unclear whether MERS-CoV can be transmitted directly from bat to human.

圖4SARS-CoV傳播途徑
Fig4TransmissionpathwayofSARS-CoV

The fruit bat is the natural reservoir of MERS-CoV,while the dromedary camel is its intermediate reservoir.The camel-to-human transmission of MERS-CoV has been confirmed,but it is still unclear whether MERS-CoV can be transmitted directly from bat to human.

圖5MERS-CoV傳播途徑
Fig5TransmissionpathwayofMERS-CoV

MERS-CoV疫情爆發(fā)后,本團(tuán)隊(duì)快速地建立起MERS-CoV假病毒系統(tǒng)和細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng),為后續(xù)的MERS-CoV入侵抑制劑的研發(fā)、活性評(píng)估及機(jī)制研究奠定了重要基礎(chǔ)[36-37]。同時(shí),我們成功地解析出MERS-CoV S2 的六螺旋結(jié)構(gòu),并根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出抗MERS-CoV的多肽類入侵抑制劑HR2P,發(fā)現(xiàn)該多肽能非常有效地抑制MERS-CoV S蛋白介導(dǎo)的膜融合及假病毒和活病毒的感染。通過(guò)對(duì)HR2P序列的優(yōu)化,獲得優(yōu)化多肽HR2P-M2,后者的水溶性、穩(wěn)定性及抗病毒活性都有顯著提高[36]。多肽HR2P-M2通過(guò)鼻道給藥,在含有hDPP4基因的重組腺病毒Ad5構(gòu)建的Ad5-hDPP4小鼠和hDPP4轉(zhuǎn)基因(hDPP4-Tg)小鼠中均顯示出非常好的保護(hù)效果[36,38-39]。另外,根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)提示,在其六螺旋的N端潛在一個(gè)疏水性口袋,針對(duì)該結(jié)構(gòu),在抗MERS-CoV多肽M0的N端添加“EAN”序列,可顯著地提高M(jìn)0多肽的抗病毒活性,也為針對(duì)于其他I型包膜病毒的多肽類入侵抑制劑的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了新思路[11]。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)將MERS-CoV S蛋白中RBD的截?cái)囿w(aa377-588)與IgG Fc fragment (S377-588-Fc)融合表達(dá)后,所獲得的重組蛋白可有效地與受體DPP4結(jié)合,并具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制MERS-CoV進(jìn)入靶細(xì)胞的效果,表明該重組蛋白可開(kāi)發(fā)成為蛋白類MERS-CoV入侵抑制劑。另外,與SARS-CoV的RBD性質(zhì)的類似[30-31,34-35],該重組蛋白含有關(guān)鍵中和位點(diǎn),可在動(dòng)物體內(nèi)誘生大量高效價(jià)的中和抗體,可直接阻斷MERS-CoV 的RBD與受體的結(jié)合,因此可開(kāi)發(fā)成安全有效的抗MERS疫苗[40-41]。在可抑制MERS-CoV進(jìn)入靶細(xì)胞的抗體研發(fā)方面,我們也取得了很大的進(jìn)展。使用MERS-CoV 的RBD免疫小鼠獲得一個(gè)鼠源單克隆中和抗體Mermab1,可有效地阻止MERS-CoV與受體的結(jié)合及MERS-CoV的入侵過(guò)程[42]。此外,我們與Dimitrov合作,利用其超大容量噬菌體全人源抗體庫(kù)篩選出一系列針對(duì)MERS-CoV RBD的全人源抗體單克隆抗體,其中的m336具有超高效價(jià)的MERS-CoV中和活性,對(duì)MERS-CoV假病毒和活病毒半數(shù)中和濃度分別為 0.005和0.07 μg/mL[43],該抗體在兔子和hDPP4-Tg小鼠體內(nèi)具有很好的保護(hù)效果[44-45]。另外,該抗體屬于人的類胚系抗體(germline-like antibody),具有對(duì)人免疫原性極低的優(yōu)點(diǎn),因而,在防治MERS-CoV感染方面具有更好的應(yīng)用前景[44,46]。

埃博拉病毒(EBOV)入侵抑制劑EBOV(Ebola Virus)屬絲狀病毒科,分為5個(gè)亞種,分別為扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型及雷斯頓型[47]。EBOV是造成埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)的病原體,埃博拉病的患者通常死于嚴(yán)重的多器官衰竭以及系統(tǒng)性感染造成的休克[48]。

EBOV主要是通過(guò)與含有高濃度病毒的患者體液接觸后發(fā)生傳播[49]。EBOV可在 EVD 幸存者的精液中持續(xù)存活數(shù)月[50],表明EBOV可通過(guò)性傳播[51]以及EVD生還者精液中長(zhǎng)期存活的EBOV可引起新的EVD爆發(fā)。

截至目前,還沒(méi)有針對(duì)EBOV的有效藥物或者疫苗被批準(zhǔn)上市。ZMapp是混合了幾種針對(duì)EBOV包膜蛋白抗體的聯(lián)合制劑[52]。 2014年,ZMapp雖然還處于動(dòng)物試驗(yàn)階段,但該抗體聯(lián)合制劑在西非的EBOV爆發(fā)流行中被成功地用于少數(shù)幾個(gè)EVD患者的治療[53]。 2016年,ZMapp臨床試驗(yàn)完成。雖然證明ZMapp 對(duì)于EVD的治療有一些效果,但遠(yuǎn)未達(dá)到其預(yù)測(cè)的功效[54]。此外,Zmapp僅能中和扎伊爾型EBOV,對(duì)其他四型EBOV不能提供保護(hù)作用[55]。

本團(tuán)隊(duì)在以前的研究中發(fā)現(xiàn)酸酐化修飾蛋白對(duì)一些病毒,如HIV[56]、HPV[57]等具有很好的抑制作用。于是我們?cè)O(shè)計(jì)并表達(dá)了一系列酸酐化修飾蛋白,發(fā)現(xiàn)3-羥基苯二甲酸酐修飾的人血清白蛋白(HP-HSA)對(duì)表達(dá)扎伊爾型和蘇丹型EBOV包膜蛋白的假病毒均具有較高的抑制活性,半數(shù)抑制濃度(IC50)達(dá)到了納摩爾水平,甚至比EBOV中和抗體MIL77-2 (ZMapp的成分之一)活性更高[58]。更重要的是,HP-HSA在45 ℃儲(chǔ)存8周后,依然保持良好的抗病毒活性。與抗體需要冷鏈運(yùn)輸及高生產(chǎn)費(fèi)用相比,該酸酐化蛋白更適合在熱帶和亞熱帶的發(fā)展中國(guó)家(特別是EBOV流行地區(qū))使用。我們發(fā)現(xiàn)HP-HSA與MIL77-2還具有協(xié)同作用的效果,使得該蛋白既能單使用,也可與其他抗EBOV的藥物聯(lián)合使用。此外,HP-HSA還可被開(kāi)發(fā)成為阻斷EBOV性傳播的殺微生物劑,在生殖道局部使用防控EBOV的性傳播。

寨卡病毒(ZIKV)入侵抑制劑ZIKV(Zika Virus)是一種蚊媒傳播病毒,與登革病毒(Dengue Virus,DENV)、黃熱病病毒(Yellow Fever Virus,YFV)和西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)同屬于黃病毒科家族成員。2007年之前,ZIKV僅偶爾在亞洲和非洲的局部地區(qū)造成零星感染。2007年后,人感染ZIKV病例逐漸增多。本次ZIKV大爆發(fā)始于巴西,并迅速傳播到美洲、非洲和亞洲的84個(gè)國(guó)家和地區(qū)[59]。ZIKV感染能損傷神經(jīng)系統(tǒng),引起包括小頭癥在內(nèi)的嚴(yán)重的先天性腦發(fā)育障礙[60-62](圖6A),并能導(dǎo)致吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome)[63-64]。研究還表明ZIKV感染能造成雄性生殖系統(tǒng)損傷[65-66]。

寨卡病毒為具有囊膜的單股正鏈RNA病毒,在ZIKV囊膜表面覆蓋著介導(dǎo)病毒感染的E蛋白。我們對(duì)E蛋白的序列進(jìn)行分析后,基于其頸部(stem)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)了一條多肽—Z2。我們研究發(fā)現(xiàn)該多肽可與ZIKV的E蛋白結(jié)合,破壞病毒膜的完整性,導(dǎo)致病毒的基因組釋出,從而滅活ZIKV病毒顆粒。在多種體外細(xì)胞模型及體內(nèi)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中,Z2多肽均能有效地抑制ZIKV的感染。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Z2多肽具有穿透胎盤屏障的能力,不僅能夠降低ZIKV感染的孕鼠血清中的病毒滴度,還能顯著降低胎盤和胎鼠的病毒感染率,從而阻止ZIKV的垂直傳播(圖6B)。該多肽滅活劑對(duì)孕鼠及胎鼠均表現(xiàn)出良好的安全性,有望發(fā)展為可防治ZIKV感染的新型藥物,尤其適用于孕婦等ZIKV感染的高危人群[67]。

經(jīng)過(guò)與應(yīng)天雷課題組合作研究,我們從超大容量噬菌體全人源抗體庫(kù)成功地篩選到一系列可與ZIKV的E蛋白的DIII結(jié)構(gòu)域(domain III)結(jié)合的全人源單克隆抗體。其中一株抗體m301能廣泛地中和多種目前流行的ZIKV毒株,并與另一株抗體m302合用具有協(xié)同效應(yīng)。表位作圖和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究表明m301和m302結(jié)合于DIII結(jié)構(gòu)域C-C’loop的相鄰區(qū)域,該區(qū)域代表了一個(gè)最近鑒定的間歇性暴露的隱蔽表位(cryptic epitope)。此隱蔽表位可能通過(guò)一個(gè)稱為病毒呼吸(viral breathing)的過(guò)程間歇性地暴露而被m301和m302抗體識(shí)別。這些人源單克隆抗體也都是類胚系抗體,與其相應(yīng)的胚系免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因有98%～100%的同源性,其與體細(xì)胞超突變抗體(somatically hypermutated antibody)相比,顯示更低的免疫原性和更好的成藥性。因此,此項(xiàng)研究有助于我們理解ZIKV抗體的抗原表位和設(shè)計(jì)更有效的抗ZIKV疫苗和血清學(xué)診斷方法,并且這些抗ZIKV的全人源中和抗體還具有進(jìn)一步研發(fā)為抗體治療藥物的潛力[68]。

A:Infection of ZIKV during pregnancy may result in congenital malformation of fetal brain and microcephaly;B:Peptide Z2 can inactivate ZIKV and reduce the virus load in maternal blood,and can also penetrate the placental barrier,thus significantly reducing the infection rate of placenta and fetus,and preventing the vertical transmission of ZIKV.

圖6ZIKV入侵抑制劑和滅活劑
Fig6EntryinhibitorsandinactivatorsofZIKV

雖然已經(jīng)確證ZIKV感染可引起包括小頭癥在內(nèi)的胎兒先天性畸形和成人吉蘭-巴雷綜合征等疾病,但對(duì)ZIKV感染孕婦后導(dǎo)致先天性畸形的胎兒的預(yù)后及其成年后可能出現(xiàn)的后遺癥知之甚少。許多ZIKV感染相關(guān)的小鼠模型雖已建立[69-70],但感染的胎鼠通常在出生之前或之后不久死亡[71-72],先天性感染的胎鼠難以成功出生并成年,限制了先天性ZIKV感染的成年后遺癥的研究及防治該后遺癥的藥物及疫苗的篩選和評(píng)估。經(jīng)過(guò)與張嘉漪課題組合作研究,我們成功地建立了一種小鼠先天性ZIKV感染新模型[73],通過(guò)羊膜腔內(nèi)注射途徑接種ZIKV,大量胎鼠順利出生并成長(zhǎng)至成年期。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠出生后ZIKV可在小鼠體內(nèi)持續(xù)感染并復(fù)制,直到成長(zhǎng)至青春期后,隨著免疫系統(tǒng)成熟,病毒可被清除。感染小鼠與對(duì)照組相比,大腦體積顯著減小,皮層變薄,視覺(jué)系統(tǒng)和小腦出現(xiàn)解剖缺陷以及顱內(nèi)鈣化,且先天性感染ZIKV的小鼠中出現(xiàn)后肢癱瘓和運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)?！皶鐖?chǎng)實(shí)驗(yàn)”、“懸尾實(shí)驗(yàn)”、“轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)”、“高架十字迷宮”、“步態(tài)分析”等行為學(xué)檢測(cè),表明先天性ZIKV感染的小鼠預(yù)后出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙以及視覺(jué)功能障礙等后遺癥,重現(xiàn)了人先天性ZIKV感染的若干臨床表現(xiàn),有助于人先天性ZIKV感染的預(yù)后研究。此模型通過(guò)采用行為學(xué)分析的預(yù)后評(píng)估系統(tǒng),可用于篩選和鑒定能修復(fù)神經(jīng)損傷從而改善預(yù)后病癥的候選藥物和評(píng)估抗ZIKV治療的預(yù)后效果。

展望病毒入侵抑制劑主要分為多肽類、抗體類、修飾蛋白類以及小分子類抗病毒藥物及其候選。其中,本團(tuán)隊(duì)在HIV、SARS-CoV、MERS-CoV、EBOV以及ZIKV多肽類及修飾蛋白類入侵抑制劑研究領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先水平。多肽類入侵抑制劑具有入侵抑制劑普遍具有的作用于病毒入侵的早期階段,能有效保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒傷害的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),由于其分子量較小,免疫原性較低,不易引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒入侵的抑制劑的抗體。但是,多肽類藥物也有其相應(yīng)的缺點(diǎn)。如20年前研發(fā)的第一個(gè)多肽抑制劑類抗HIV藥物——T20具有抗病毒活性低[4],臨床用量大,注射次數(shù)多等缺點(diǎn)。這些問(wèn)題正在通過(guò)選取對(duì)膜蛋白親和力更高的結(jié)構(gòu)域[7],添加人工設(shè)計(jì)的鉤狀結(jié)構(gòu)[9-11],設(shè)計(jì)酯化肽[14]等手段解決。另一問(wèn)題是由于其分子量較小,導(dǎo)致其半衰期較短,臨床使用時(shí)導(dǎo)致用藥頻率較高。研究人員采用在全人工設(shè)計(jì)的非天然序列中引入β氨基酸[16]或使用酸酐修飾C-多肽使其與人血清白蛋白發(fā)生快速和不可逆轉(zhuǎn)的結(jié)合[74]等方法一定程度上延長(zhǎng)了多肽類藥物的半衰期,但長(zhǎng)效多肽的研發(fā)仍然是未來(lái)研究需努力的方向之一。另外,由于RNA病毒基因組易發(fā)生突變,各病毒均有各種不同的亞型,不同區(qū)域的流行亞型也不盡相同,所以開(kāi)發(fā)針對(duì)病毒在入侵過(guò)程中具有重要作用的保守位點(diǎn)(如6-HB)的廣譜抗病毒藥物也是未來(lái)抗病毒藥物的發(fā)展重點(diǎn)之一。尤其是對(duì)于新發(fā)病毒(如MERS-CoV和ZIKV)來(lái)說(shuō),如果能提前開(kāi)發(fā)出廣譜抗冠狀病毒和廣譜抗黃病毒的藥物,可在這些新發(fā)病毒疫情發(fā)生時(shí),第一時(shí)間使用來(lái)挽救感染者的性命,大大節(jié)省國(guó)家的公共衛(wèi)生投入。

修飾蛋白類藥物作為局部使用藥物可防控病毒的性傳播,如酸酐修飾的牛血清白蛋白作為針對(duì)HPV的陰道用殺微生物劑,其有效性和安全性都在臨床試驗(yàn)中得到了確認(rèn)[75-76]。其中酸酐修飾的β乳球蛋白對(duì)HIV-1、HIV-2、HPV、HSV及EBOV也具有廣譜的抑制效果[56-58,77]。修飾類蛋白局部用藥劑型生產(chǎn)成本低、作用廣譜、性質(zhì)穩(wěn)定、非常安全、使用方便,十分適合被開(kāi)發(fā)成可防控上述病毒性傳播的局部用藥。

抗體類病毒入侵抑制劑多為針對(duì)病毒包膜蛋白特定位點(diǎn)的單克隆抗體,特別是全人源的類胚系抗體,具有抗病毒活性高和免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。但是,抗體藥物在病毒防治領(lǐng)域較難推廣使用的重要原因之一是其制造成本太高。為解決這一問(wèn)題,學(xué)界也進(jìn)行了很多研究,包括開(kāi)發(fā)分子量較小的新結(jié)構(gòu)抗體,以及將抗體與多肽藥物聯(lián)合使用來(lái)降低抗體藥物的使用量等手段。同時(shí),抗體類入侵抑制劑針對(duì)的病毒表位單一,易出現(xiàn)病毒逃逸的情況。研究人員也因此提出聯(lián)合使用多種單克隆抗體或構(gòu)建雙/三特異性抗體等來(lái)解決病毒逃逸的問(wèn)題,但是這將更進(jìn)一步增加用藥成本。所以本團(tuán)隊(duì)提出聯(lián)合使用抗體類和多肽類入侵抑制劑的策略,以期大大增加藥物靶向的位點(diǎn)范圍,減少耐藥情況產(chǎn)生。

以上多肽類以及抗體類入侵抑制劑同樣具有的一個(gè)問(wèn)題是只能通過(guò)注射用藥,相較于口服藥,患者依從性較低。小分子類入侵抑制劑能有效解決這些問(wèn)題。但目前小分子類入侵抑制劑的活性普遍較低,還不適合開(kāi)發(fā)成藥物。所以該類病毒入侵抑制劑的研究方向仍聚焦于如何有效提高其抗病毒活性。

病毒滅活劑能作用于患者體內(nèi)的游離病毒,在藥物利用率等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。如能通過(guò)胎盤的ZIKV多肽滅活劑Z2不僅能用于治療母體的感染,還能保護(hù)胎兒不受病毒感染。由于Z2多肽具有滅活游離病毒的功能,可以在病毒進(jìn)入胎鼠腦部前將病毒滅活,因此可有效減低胎鼠腦部的病毒感染率,具有顯著的優(yōu)勢(shì)[67]。此外,病毒滅活劑還可被發(fā)展成為清除HIV潛伏細(xì)胞的細(xì)胞殺滅劑,在艾滋病治愈藥物的開(kāi)發(fā)上具有潛力。例如,HIV潛伏庫(kù)的清除一直是HIV治愈領(lǐng)域的一大研究重點(diǎn),其中激活并殺死(shock and kill)的策略被認(rèn)為是最有希望清除HIV潛伏庫(kù)的方法之一[78]。HIV滅活劑就能運(yùn)用到該策略上,直接滅活被激活的潛伏病毒,有效保護(hù)機(jī)體不受激活后產(chǎn)生的新病毒的影響,并且還能通過(guò)偶聯(lián)毒素等策略設(shè)計(jì)成為有效地將被激活的、表面表達(dá)HIV-1 Env的潛伏細(xì)胞殺滅,從而將其清除。所以,設(shè)計(jì)出滅活效率高的病毒滅活劑是今后抗病毒治療及治愈藥物發(fā)展的一大方向。

致謝感謝聞?dòng)衩吩菏?、袁正宏教授及醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室其他同事的大力支持,感謝姜世勃/陸路課題組全體成員的貢獻(xiàn)。

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Defeatingenemyoutsidetheborder-developmentofviralentryinhibitors

JIANG Shi-bo△, SU Shan, XIA Shuai, ZOU Peng, LU Lu

(MOE/MOHKeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

About 25 years ago,we had pioneered the research fields of developing human immunodeficiency virus (HIV) fusion/entry inhibitors and anti-HIV peptide drugs.Over the past six years,we have gained some promising results in research and development of the HIV,Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-COV),the Ebola virus (EBOV),and the Zika virus (ZIKV) entry inhibitors.This article provides an overview of the research progress of viral entry inhibitors against the related highly pathogenic viruses.

highly pathogenic viruses; virus entry inhibitors; virus inactivators

R511

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.0014

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81102476,81173098,81261120382,81361120378,81373456,81410308013,81590762,8161101485,81630090,81672019);國(guó)家重點(diǎn)研究計(jì)劃“生物安全關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”重點(diǎn)項(xiàng)目 (2016YFC1201000,2016YFC1200400,2016YFC1202901)

△Corresponding author E-mail:shibojiang@fudan.edu.cn

*ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(81102476,81173098,81261120382,81361120378,81373456,81410308013,81590762,8161101485,81630090,81672019)andNationalKeyResearchProgramofChina-ResearchandDevelopmentofKeyTechnologiesforBiosafety(2016YFC1201000,2016YFC1200400,2016YFC1202901).

2017-09-30;編輯:張秀峰)