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·論著·

不同動物源腸球菌耐藥性及毒力基因測定與分析

陳麗穎1,2，張留君1，秦明明1，陳飛1，金鉞1,2，胡慧1,2，王亞賓1,2

目的通過測定120株不同來源腸球菌耐藥性分布情況，毒力基因cylA、efaA、gelE、esp、ace和AS的攜帶率，旨在了解腸球菌耐藥現(xiàn)狀和毒力基因分布情況，為選擇臨床治療方案和探索腸球菌致病機制提供參考。方法設計6對特異性引物，應用PCR方法對分離到的120株腸球菌進行6種毒力基因檢測，同時用紙片擴散法對11種常用抗生素進行耐藥性試驗。結果120個腸球菌分離株對抗生素均具有3重以上的耐藥性，且不同來源菌株的多重耐藥性有明顯差異，其中以病死豬內臟分離株多重耐藥性最為嚴重；總體上，上述分離株對林可霉素耐藥率最高，為達96.00%(115/120)，對環(huán)丙沙星、卡那霉素、四環(huán)素和達福普汀的耐藥率均達到50%以上，而對替考拉寧的耐藥率最低，僅為0.83%(1/120)。6種毒力基因cylA、efaA、gelE、esp、ace和AS在受試菌株中的陽性檢出率依次為39.17%、56.67%、68.33%、23.33%、26.67%和13.33%；不同來源的腸球菌毒力基因攜帶率不同，且攜帶毒力基因數(shù)量也有明顯差異，其中，來自病死豬內臟的腸球菌分離株攜帶毒力基因的比例較高，且有超過50%的菌株同時攜帶4種毒力基因及以上。結論腸球菌的耐藥率和多重耐藥性與毒力基因攜帶陽性率有一致性，且與菌株來源關系密切，因此對這一傳統(tǒng)意義上的機會性病原體值得深入研究其中的因果關系。

動物；腸球菌；毒力基因；耐藥性；聚合酶鏈式反應

腸球菌分布廣泛，是一種重要的條件性致病菌，也是人和動物胃腸道常在菌群成員[1]。近年來，腸球菌已成為醫(yī)院內感染的重要病原之一，由其引發(fā)的醫(yī)院內感染率不斷上升[2-3]。腸球菌還可引起人類食物中毒。另外，腸球菌也可以感染豬、雞、家蠶、羔羊、驢等多種動物[4-5]。另有研究表明，腸球菌可以在人與動物之間進行水平傳播[6]。大量資料顯示，腸球菌已經成為具有重要公共衛(wèi)生學意義的人獸共患病原體。

腸球菌毒力因子與其致病性密切相關，目前已發(fā)現(xiàn)十多種[7-10]。大量研究表明，不同種類腸球菌的毒力基因攜帶率有明顯差異，而且腸球菌的毒力因子表型隨宿主、環(huán)境等多種因素影響而變化復雜。Shankar等(2002)鑒定出糞腸球菌第一個致病島(pathogenicity island，PAI)并發(fā)現(xiàn)其中含有cyl、esp和agg等毒力基因[9]。吳敏等(2008)報道糞腸球菌菌株毒力基因陽性率和數(shù)量均明顯高于屎腸球菌菌株[11]，但Worth等(2008)發(fā)現(xiàn)來自住院病人的屎腸球菌VRE菌株攜帶esp基因的比例高達81.5%[12]。

近年來，由于在人和動物臨床中廣泛和大劑量應用抗生素，細菌耐藥性問題日益突出，給臨床治療帶來了極大困難[12-13]。研究證明，腸球菌對多種抗生素有耐受性且具有固有耐藥和獲得性耐藥的特性[14-15]。因此監(jiān)測腸球菌的耐藥狀況和尋找高效抗菌藥物對于人類醫(yī)學和獸醫(yī)實踐均具有重要的參考價值和指導意義。

本研究選擇11種常用抗菌藥物，采用紙片擴散法(K-B法)，對自行分離的120個不同來源腸球菌菌株進行了耐藥性檢測。同時，應用PCR方法檢測了腸球菌的6種常見毒力基因，依此分析不同來源腸球菌耐藥性及其與毒力基因分布的關系。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1受試菌株 120株腸球菌均由河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院微生物實驗室分離，并經細菌常規(guī)生化試驗、16S rRNA基因測定和Vitec-32全自動細菌生化鑒定系統(tǒng)等鑒定至種(屬)。菌株來源與數(shù)量分別為：牛糞便分離株16，羊糞便分離株21,豬糞便分離株13，蜂猴糞便分離株17，生鮮豬肉分離株19，病死豬內臟分離株34。上述菌株均于50%甘油中在-20 ℃保存，臨用時接種于添加0.5%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)活化。

1.2主要藥品與培養(yǎng)基、試劑 供試藥敏紙片慶大霉素(10 μg/片，GM)、萬古霉素(30 μg/片，VA)、替考拉寧(30 μg/片，TCL)、環(huán)丙沙星(5 μg /片，CIP)、氯霉素(30μg /片，C)、卡那霉素(30 μg /片，K)、紅霉素(15 μg /片，E)、四環(huán)素(30 μg /片，TE)、氨芐西林(10 μg /片，AM)和林可霉素(2 μg /片，林)均由北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司提供；鏈陽霉素(15 μg /片，QD，奎奴普汀/達福普汀)由賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司提供。BHI培養(yǎng)基由上海西寶生物科技有限公司生產。

2×PCR TaqMix和EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；瓊脂糖(西班牙進口分裝)、溶菌酶和DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；酚、氯仿、異戊醇購自鄭州瑞興科技有限公司；其他試劑均為國產分析純產品。

1.3主要儀器設備 主要包括：PTC-200型PCR擴增儀(美國Bio-rad公司)，SIGMA3K30高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，ZF型紫外投射反射分析儀(上?？等A生物儀器制造廠)；SHA-C水浴恒溫振蕩器；微量加樣器(德國Eppendorf公司)；sp-D垂直凈化工作臺(蚌埠凈化設備廠)；AlphaImagerTM2200型凝膠成像儀(美國ProteinSimple公司)。

1.4細菌耐藥表型檢測 采用紙片擴散法(K-B法)。分別取分離菌株培養(yǎng)物100 μL于BHI瓊脂平板上(每平皿傾注培養(yǎng)基約15 mL，厚度約2～3 mm)，用細菌涂棒均勻涂布；待菌液稍干燥后，將藥敏紙片緊貼于平板表面，以藥敏片間距不少于24 mm、紙片中心距平皿邊沿不少于15 mm為宜，37 ℃培養(yǎng)24 h；用游標卡尺測量各抑菌圈直徑，并記錄結果。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI，M100-S22，2012)的標準進行敏感性結果判讀[16]。

1.5 細菌毒力基因測定

1.5.1細菌基因組DNA的提取 采用EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，按照試劑盒使用說明進行操作，提取腸球菌基因組DNA并經核酸電泳檢查。

1.5.2腸球菌6種毒力基因PCR引物設計及合成

根據(jù)GenBank和文獻[18]公布的基因序列，自行設計檢測腸球菌6種常見毒力基因的PCR引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和目的條帶大小見表1。

1.5.3PCR反應體系 25 μL PCR反應體系：其中2×PCR TaqMix 8 μL；上、下游引物各1 μL；模板DNA 2 μL，最后補充雙蒸去離子水至25 μL總量。

1.5.4擴增程序 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火各1 min，退火溫度分別為:cylA53.3 ℃、ace46.5 ℃、gelE51.7 ℃、efaA54 ℃、AS54.6 ℃、esp58.1 ℃，72 ℃延伸1 min，從第2步開始30個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，最后12 ℃保存。

1.5.5空白對照 反應體系中未加入DNA模板，用雙蒸去離子水代替模板，擴增條件同上。

1.5.6PCR產物分析 取10 μL PCR 產物，經含GoldView 的1.0%瓊脂糖凝膠110 V電壓下電泳30 min后，用紫外投影儀觀察結果，以Marker DL 2000為分子量對照，觀察擴增片斷的長度。然后，將擴增產物進行膠回收并送至上海生工進行測序。

表1 六種毒力基因引物序列
Tab.1 Primer sequences for six virulence genes

基因Gene引物序列5′-3′Primersequence，5′-3′目的條帶大小/bpProductlengthcylA上游ForwardGATGGGACAGATGGAAAC431下游ReverseGAAACTAGCGATGTAGGGace上游ForwardAAAGTAGAATTAGATCCACAC320下游ReverseTCTACTACATTCGGTTGCGgelE上游ForwardAGTTCATGTCTATTTTCTTCAC402下游ReverseCTTCATTATTTACACGTTTGefaA上游ForwardGTGAGAAAGAAATGGAGGA499下游ReverseCTACTAACACGTCACGAATGAS上游ForwardCCAGTAATCAGTCCAGAAACAACC406下游ReverseTAGCTTTTTTCATTCTTGTGTTTGTTesp上游ForwardTTGCTAATGCTAGTCCACGACC932下游ReverseGCGTCAACACTTGCATTGCCGA

2 結 果

2.1 耐藥性試驗結果

2.1.1腸球菌耐藥性試驗總體結果 試驗發(fā)現(xiàn)，120個腸球菌分離株對替考拉寧的耐藥率最低，僅為0.83%(1/120)；對林可霉素耐藥率最高，為96.00%(115/120)；而50%以上的菌株對環(huán)丙沙星、卡那霉素、四環(huán)素、達福普汀耐受。上述腸球菌分離株對替考拉寧和氨芐西林的敏感率較高，分別為75.00%(90/120)和74.17%(89/120)；全部菌株對林可霉素不敏感。詳見表2。

表2 腸球菌總體耐藥性試驗結果(%)
Tab.2 Antibiotic resistance test results of Enterococcus isolates

藥物Drug耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive藥物Drug耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive慶大霉素Gentamicin81．67107．50四環(huán)素Tetracycline80．836．6710．83環(huán)丙沙星Ciprofloxacin54．1738．335．00紅霉素Erythromycin45．0049．175．83萬古霉素Vancomycin20．8336．6742．50氨芐西林Ampicillin22．50074．17替考拉寧Teicoplanin0．8324．1775．00林可霉素Lincomycin96．004．000氯霉素Chloromycetin36．6712．5050．83達福普汀Dalfopristin64．1725．009．17卡那霉素Kanamycin87．913．308．79

2.1.2不同來源腸球菌分離株對11種常見抗菌藥耐藥性試驗結果 經檢測，不同來源腸球菌對抗生素的耐受性不同(詳見表3)。其中，各種來源腸球菌均對林可霉素高度耐藥(耐藥率在90%以上)；對替考拉寧耐藥的菌株僅局限于豬糞源腸球菌(7.69%)；腸球菌對卡那霉素的耐藥率也非常普遍，耐藥率均高于70%；此外，各來源腸球菌菌株對慶大霉素和達福普汀的耐藥性均超過45%。

表3 不同來源腸球菌耐藥性試驗結果 (%)
Tab.3 Antibiotic resistance test results of swine and sheep fecal Enterococcus isolates (%)

抗菌藥Drug豬糞源分離株Swinefecalisolates羊糞源分離株Ovinefecalisolates耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive慶大霉素Gentamicin92．3107．6942．8628．5728．57環(huán)丙沙星Ciprofloxacin15．3876．927．6919．0557．1423．81萬古霉素Vancomycin30．7738．4630．774．7619．0576．19替考拉寧Teicoplanin7．697．6984．6204．7695．24氯霉素Chloromycetin53．85046．1514．2914．2971．43卡那霉素Kanamycin76．9215．387．6976．19023．81四環(huán)素Tetracycline92．3107．6923．8128．5747．62紅霉素Erythromycin84．627．697．699．5285．714．76林可霉素Lincomycin1000090．489．520達福普汀Dalfopristin69．2330．77047．6247．624．76氨芐西林Ampicillin30．77069．2319．05080．95抗菌藥Drug蜂猴糞源腸球菌Lorisfecalisolates牛糞源腸球菌Bovinefecalisolates耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive慶大霉素Gentamicin1000068．7531．250環(huán)丙沙星Ciprofloxacin47．0635．29025．0075．000萬古霉素Vancomycin58．8241．18012．5056．2531．25替考拉寧Teicoplanin029．4170．59018．7581．25氯霉素Chloromycetin41．1841．1817．656．256．2587．50卡那霉素Kanamycin———87．50012．50四環(huán)素Tetracycline88．240087．506．256．25紅霉素Erythromycin47．0641．1811．7612．5075．0012．50林可霉素Lincomycin0088．2418．75081．25達福普汀Dalfopristin———10000氨芐西林Ampicillin70．5911．765．8856．2531．2512．50抗菌藥Drug病死豬內臟源腸球菌Diseasedviscusisolates生鮮肉源腸球菌Rawporkisolates耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive慶大霉素Gentamicin94．122．942．9447．37052．63環(huán)丙沙星Ciprofloxacin94．125．88078．9521．050萬古霉素Vancomycin11．7620．5967．6521．0563．1615．79替考拉寧Teicoplanin047．0652．94015．7984．21表3(續(xù))抗菌藥Drug病死豬內臟源腸球菌Diseasedviscusisolates生鮮肉源腸球菌Rawporkisolates耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive耐藥率Resistant中介率Intermediate敏感率Sensitive氯霉素Chloromycetin76．4711．7611．7600100卡那霉素Kanamycin97．062．94010000

四環(huán)素Tetracycline94．122．942．9410000紅霉素Erythromycin73．5326．47031．5863．165．26林可霉素Lincomycin11．76088．2473．68026．32達福普汀Dalfopristin——————氨芐西林Ampicillin76．478．8214．7157．8931．5810．53

2.1.3不同來源腸球菌多重耐藥結果 腸球菌的多重耐藥測定結果顯示，各腸球菌分離株均具有3重以上的耐藥性，但不同來源菌株的多重耐藥性有統(tǒng)計學差異。其中以病死豬內臟分離株表現(xiàn)最為嚴重，達到或超過7重耐藥的菌株占比高達61.53%(21/34)；豬糞便、生鮮肉、蜂猴糞便分離株中超過6重耐藥的菌株亦在50%以上；相比之下，羊糞便分離株的多重耐藥現(xiàn)象略輕，絕大多數(shù)菌株均在5重耐藥以下(20/21)。

2.2 不同來源腸球菌6種毒力基因檢測結果

2.2.1腸球菌6種毒力基因PCR檢測結果 腸球菌6種毒力基因cylA、efaA、gelE、esp、ace、AS的PCR擴增片段預期大小依次為431 bp、499 bp、402 bp、932 bp、320 bp和406 bp(如圖1)。擴增產物經測序證明其序列正確。PCR結果顯示，120株腸球菌分離株攜帶上述6種毒力基因的陽性率分別為30.19%(cylA)、59.12%(efaA)、75.47%(gelE)、18.24%(esp)、26.42%(ace)和10.06%(AS)，其中以gelE基因的攜帶率最高，而AS基因攜帶率最低。在各分離株中同時攜帶3種、4種、5種、6種毒力基因的菌株分別有27株(22.5%)、12株(10.0%)、9株(7.5%)和5株(4.17%)。

2.2.2不同來源腸球菌毒力基因攜帶情況與分析

不同來源腸球菌毒力基因攜帶情況見表4。由表4可知，各毒力基因的攜帶情況在不同來源的腸球菌菌株中有顯著區(qū)別。其中，efaA基因在生鮮肉分離株中攜帶率高達89.4%，而在牛糞源腸球菌中最低(18.8%)；AS基因在各種來源分離株中攜帶率均最低。

值得注意的是，病死豬內臟分離株毒力基因攜帶率明顯高于其他來源菌株，尤其是gelE和cylA基因的陽性率均高達97.1%(33/34)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該來源菌株中同時攜帶多種毒力基因的數(shù)量也顯著高于其他來源菌株，例如，同時攜帶4～6種毒力基因的菌株數(shù)高達13個(13/34)。

M:DNA分子量標記 A：部分菌株efaA基因PCR電泳圖 B：部分菌株cylA基因PCR電泳圖 C：部分菌株esp基因的PCR電泳圖 編號1～21表示分離菌株。M：DNA marker A:Gel eleclrophoresis for PCR product of virulence gene efaA B:Gel electrophoresis for PCR product of virulence gene cylA C:Gel electrophoresis for PCR product of virulence gene esp No 1～21:number of isolates圖1 部分腸球菌分離株的部分毒力基因PCR電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis result of some virulence genes in Enterococcal isolates

表4 不同來源腸球菌分離株毒力基因攜帶情況
Tab.4 Carriage rates of virulence genes in Enterococci isolates from different sources

毒力基因Virulencegene牛糞便Bovinefeces羊糞便Ovinefeces豬糞便Swinefeces陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%efaA3/1618．88/2138．18/1361．5gelE6/1637．511/2152．45/1338．5esp2/1612．54/2119．05/1338．5AS2/1612．54/2119．01/137．7ace0/1607/2133．35/1338．5cylA2/1612．54/2119．04/1330．8毒力基因Virulencegene蜂猴糞便Lorisfeces生鮮肉Rawpork病死豬內臟Deadpigviscus陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%陽性數(shù)/樣品數(shù)Positive/sample攜帶率%Carriage%efaA15/1788．217/1989．417/3450．0gelE13/1776．414/1973．633/3497．1esp5/1729．42/1910．510/3429．4AS0/1702/1910．57/3420．6ace4/1723．54/1921．112/3435．3cylA4/1723．50/19033/3497．1

3 討 論

當前，細菌耐藥性腸球菌耐藥性越來越強，臨床發(fā)病報道越來越多。腸球菌屬因其固有和獲得性耐藥性，給臨床腸球菌感染的治療造成了很大困難，治療腸球菌感染應依據(jù)分離株的耐藥特點選擇相應的治療方案，嚴格控制抗菌藥的使用，以達到最好的治療效果和減少新的耐藥菌株的產生。

本次分離的腸球菌菌株對臨床常用的抗菌藥物均產生了一定的耐藥性，且多為具有多重耐藥的菌株。這與來源于醫(yī)院內感染腸球菌株的耐藥性報道相同[17]。在耐藥性試驗中，病死豬內臟中分離的腸球菌耐藥性也要高于其他來源菌株，而且其多重耐藥性也明顯較高；而且，具有6重耐藥性以上菌株占病死豬內臟中分離株總數(shù)79.41%，居6種來源腸球菌之首。這在人源分離株中也有類似報道[18]。

腸球菌感染的致病機制復雜，單一毒力因子并不能決定其致病性，而是有多種因子參與其致病過程[16]。目前公認的腸球菌主要毒力因子有Cyl、GelE、AS、Ace、Esp和EfaA，這些毒力因子在抵抗機體的免疫清除，增強腸球菌吸附、侵入、抗殺死以及損傷機體的能力方面起著不同的作用。本次調查的病死豬內臟分離株攜帶毒力基因的種類和數(shù)量遠高于其他來源腸球菌分離株，也說明病死豬內臟分離株較其他來源腸球菌具有較高的毒力。

祝進等研究分析了糞腸球菌健康人分離株和臨床分離株的毒力基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)臨床分離株毒力基因陽性率明顯高于健康人分離株[17]。本研究對120株不同來源腸球菌的毒力基因的檢測結果表明，分離自病死豬內臟的菌株毒力基因攜帶率明顯高于其他來源的腸球菌。由此可見，在腸球菌由正常定植菌到致病菌的轉變過程中，其主要毒力因子的表達同時增強，但其機制尚有待于進一步研究。

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DrugresistancespectrumandvirulencegenedistributioninEnterococcusisolatesofanimalorigin

CHEN Li-ying1,2, ZHANG Liu-jun1, QIN Ming-ming1, CHEN Fei1, JIN Yue1,2, HU Hui1,2, WANG Ya-bin1,2

(1.CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China; 2.HenanKeyLaboratoryofAnimalFoodSafety,Zhengzhou450002,China)

One hundred and twenty enterococcal isolates, which were identified from animal specimen, were investigated for the drug-resistance and virulence gene status ofEnterococci, so as to provide reference for clinical therapy as well as exploration ofEnterococcuspathogenicity. For the 120Enterococcusisolates, six virulence genescylA,efaA,Gele,esp,aceandASwere detected with PCR method, and drug-resistance of 11 commonly used antibiotics were measured by K-B disk diffusion tests. The results showed that all of the 120 isolates presented resistance to at least 3 kinds of drugs, and multi-resistance occurred among different originated strains, especially prominent among those isolates from dead swine organs. Generally, the isolates performed highest resistance ratio against lincomycin (115/120), and more than 50 percent isolates were resisted to ciprofloxacin, kanamycin, tetracycline and dalfopristin, while the isolates were least resistant to teicoplanin (1/120). The incidence ofcylA,efaA,GelE,esp,aceandASvirulence genes, as a whole, was 39.17%, 56.67%, 68.33%, 23.33%, 26.67% and 13.33%, respectively, but it varied markedly among those of different sources, which showed consistent trend with that drug resistance. It is concluded that the drug-resistance incidence among the test enterococcal isolates showed correlation with that of virulence gene status, and both were closely related to the bacteria origin, therefore, the conventional opportunisticEnterococcusis of value for further exploring these profound relations.

animal;Enterococcus; virulence gene; drug-resistance; polymerase chain reaction

Wang Ya-bin, Email: ybwang8686@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.007

河南省重點科技攻關項目(No.152102310081)

王亞賓，Email：ybwang8686@126.com

1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002；

2.河南省動物性食品安全重點實驗室，鄭州 450002

R378.1

A

1002-2694(2017)11-0984-07

Supported by the Henan Provincial Science and Technology Key Project(No.152102310081)

2017-06-26編輯李友松