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·論著·

多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)檢測病毒性腦炎腦膜炎病原體

樊歡，戚宇華，朱政，崔侖標(biāo)，葛以躍，趙康程，吳濤，史智揚(yáng)

目的建立一種病毒性腦炎腦膜炎病原體多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色的檢測方法。方法針對幾種重要的腦炎腦膜炎病毒(東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、流行性乙型腦炎病毒、西尼羅病毒和尼帕病毒)保守區(qū)基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)、核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色反應(yīng)，對多種腦炎腦膜炎病毒同時進(jìn)行檢測，以森林腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒4種病原核酸評價其檢測特異性，以體外轉(zhuǎn)錄的病毒RNA或擴(kuò)增的PCR片段評價其檢測敏感性, 并對流行性乙型腦炎患者臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果成功建立了一種腦炎腦膜炎病毒多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色的檢測技術(shù)。建立的檢測方法可特異的檢測目的病原體，且與森林腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒無交叉反應(yīng)。該方法對不同靶標(biāo)的檢測靈敏度均為103拷貝/μL, 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果均為陽性。結(jié)論建立的腦炎腦膜炎病毒多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)的檢測方法，具有較高的檢測特異性及靈敏度，檢測通量高，肉眼即可觀察結(jié)果，在傳染病病原體檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

病毒性腦炎腦膜炎；多重PCR；核酸侵入反應(yīng)；納米金顯色

病毒感染引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷已經(jīng)逐漸成為臨床上最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。其臨床表現(xiàn)為：發(fā)熱、頭疼、嘔吐、意識模糊、頸項(xiàng)強(qiáng)直、呼吸衰竭、多器官損傷，甚至導(dǎo)致死亡。常見的可能誘發(fā)腦炎腦膜炎的病毒包括蟲媒病毒類的東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、流行性乙型腦炎病毒和西尼羅病毒，副粘病毒科尼帕亨德拉病毒屬的尼帕病毒等，這5種病毒均為RNA病毒，且均為烈性人獸共患傳染病病原體，可造成烈性傳染病暴發(fā)流行，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的安全[1-3]。不同腦炎腦膜炎病毒引起人的感染癥狀及流行特征相似，因此僅靠臨床癥狀很難明確病原體，因此亟待研究一種早期快速準(zhǔn)確鑒別這5種病毒的檢測方法。

當(dāng)前，針對腦炎腦膜炎病毒的PCR(包括熒光定量PCR)診斷技術(shù)已在國內(nèi)外得到應(yīng)用。然而腦炎腦膜炎病毒種類繁多，熒光定量PCR檢測技術(shù)由于熒光相互干擾很難做到高通量檢測，多重PCR檢測技術(shù)雖然通量高，但其擴(kuò)增產(chǎn)物需要通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，不僅操作繁瑣，需要電泳設(shè)備，而且很難區(qū)分與目的條帶大小接近的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。針對以上不足，本研究利用多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)[4-5]及納米金顯色技術(shù)[6]建立了一種針對腦炎腦膜炎病毒的檢測方法，可對東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、流行性乙型腦炎病毒、西尼羅病毒和尼帕病毒同時進(jìn)行檢測，以期為腦炎腦膜炎病毒的快速鑒定提供一種敏感、特異、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1毒株與樣本選擇 東方馬腦炎病毒(EEEV)E2基因、西方馬腦炎病毒(WEEV)、E1基因、西尼羅病毒(WNV)、non-structural protein 5基因及尼帕病毒(NiPA)nucleoprotein 基因?yàn)楸本┝先A大基因科技有限公司合成，并克隆于pUC57載體。流行性乙型腦炎病毒(JEV)、森林腦炎病毒(TBEV)、圣路易腦炎病毒病病毒(StLEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV) 和登革病毒(DV)均為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。

1.1.2儀器與試劑 全自動核酸提取儀MagNA Pure LC及配套試劑(Roche公司)，QIAxcel毛細(xì)管電泳儀及配套試劑(QIAGEN公司)，Multiplex PCR Kit(QIAGEN公司)。發(fā)卡探針、核酸內(nèi)切酶及納米金探針由南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所周國華課題組提供。

1.2 方法

1.2.1核酸提取 采用Roche公司MagNA Pure LC全自動核酸提取儀和MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit提取上述毒株核酸并放置于-80 ℃保存。

1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Invitrogen公司SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix 說明書操作方法，使用該試劑盒提供的隨機(jī)引物將JEV、TBEV、StLEV、CHIKV和DV病毒核酸逆轉(zhuǎn)錄為DNA置于-20 ℃保存。

1.2.3多重PCR引物及核酸侵入反應(yīng)探針的設(shè)計(jì)與合成 檢索文獻(xiàn)、查詢NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，下載病原體基因序列，通過MEGA 5.1軟件進(jìn)行序列比對，查找上述病原基因保守序列，確定待測病原體靶片段。通過Primer 5.0設(shè)計(jì)針對各病原體的擴(kuò)增引物。利用Universal Invader 1.2.4 軟件設(shè)計(jì)核酸侵入反應(yīng)的上、下游探針。序列如表1及表2所示，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 多重PCR引物
Tab.1 Primers of multiplex PCR

引物Primer序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)片段大小/bpFragmentlengthEEEV?FTCACCCAGTATAAGCTGGCA278EEEV?RGTAATAGCCGTGGTGCGACAWEEV?FACCACAAGTTAAATGCTGCG299WEEV?RGTGAGGAACCTGGCGTGACGWNV?FGACACTACTCCYTTYGGVCA301WNV?RCCCGCAGATGYGCCTCRCGCNiPA?FTGATTAGATCTCCGAGTGCT286NiPA?RAGACCGTAAGCTCGGCTGTCJEV?FCACTGACATYTCRACGGTGG302JEV?RTTGCCGCCTGGGACGCCCYW

表2 核酸侵入反應(yīng)探針
Tab.2 Probes of invasive reaction

探針Probe序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)EEEV?F′CAACCTGCATGTGCGCATEEEV?R′CGCGCCGAGGCCTCWGCCCCTTGTWEEV?F′AGGGTACACACCGCCRAAAATWEEV?R′CGCGCCGAGGCGCGGCATGTGTAAWNV?F′CCGCCAGAAGGAGTGAAGTTWNV?R′CGCGCCGAGGAYGTSCTCAAYGAGACNiPA?F′CARGAGGAGATGGAAGGCTTGTNiPA?R′CGCGCCGAGGATGAGAATCCTCAARACTGCJEV?F′TGCGCTGARTAATTCCMATGGTCJEV?R′CGCGCCGAGGTTTCYGARGTGGTGG

1.2.4多重PCR反應(yīng) 利用表1中多重PCR引物，參照QIAGEN Multiplex PCR Kit說明書配置多重PCR反應(yīng)體系(20 μL)，每個體系中均含5對擴(kuò)增引物，終濃度為1 μmol，向各體系中分別加入EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV核酸模板，并設(shè)置陰性對照。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性、15 min, 94 ℃、30 s，60 ℃、90 s, 72 ℃、90 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，99 ℃，10 min滅活DNA酶。擴(kuò)增產(chǎn)物通過QIAxcel毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測驗(yàn)證。

1.2.5核酸侵入反應(yīng)及納米金探針雜交反應(yīng) 核酸侵入反應(yīng)體系(20 μL)包括：上、下游核酸侵入反應(yīng)探針及發(fā)卡探針0.2 μmol，發(fā)卡探針序列為：5′-GTCTTGTGGTACTGCACTCGTCTCGGTTTT-CCGAGACGAGTCCTCGGCGCGAATATTGAT-AATCAT-3′，核酸內(nèi)切酶AfuFEN 1 L，體系配制完成后，每管加入10 μL礦物油，再加入5 μL多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸侵入反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、1 min,63 ℃、20 min。向反應(yīng)完成的核酸侵入反應(yīng)體系中加入納米金探針6 μL，3 mol NaCl 5 μL震蕩混勻后55 ℃，30 min進(jìn)行納米金顯色反應(yīng)。

1.2.6特異性試驗(yàn) 采用上述多重PCR擴(kuò)增體系，分別擴(kuò)增EEEV、WEEV、WNV、NiPA、JEV、TBEV、StLEV、CHIKV和DV的核酸樣品，每一種反應(yīng)產(chǎn)物均采用方法中的5種核酸侵入反應(yīng)探針進(jìn)行檢測，以觀察該方法的檢測特異性。

1.2.7敏感性試驗(yàn) 針對RNA病毒JEV、EEEV、WEEV、WNV及NiPA病毒樣本，以帶有T7 RNA聚合酶啟動子序列(5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG-3′)的上游引物和下游引物對病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，以T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得每一種病原的RNA，純化定量后10倍稀釋成1×100～1×104拷貝模板/μL。取1 μL梯度稀釋后的模板，采用上述多重PCR反應(yīng)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)進(jìn)行檢測。

1.2.8臨床標(biāo)本檢測 取15份乙腦病毒抗體檢測陽性病人的急性期血清標(biāo)本,提取RNA, 按照上述多重PCR反應(yīng)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)進(jìn)行檢測。同時, PCR反應(yīng)產(chǎn)物送上海生工技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié) 果

2.1多重PCR反應(yīng) 對EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV的核酸目的片段進(jìn)行多重PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過QIAxcel毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均在預(yù)測位置上出現(xiàn)單一的目的條帶(見圖1)。

1：size marker；2：陰性對照；3-7：EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV目的片段擴(kuò)增條帶1: size marker; 2: negative control; 3-7: multiplex PCR amplification results of EEEV, WEEV, WNV, NiPA and JEV圖1 多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)圖Fig.1 Capillary electrophoretogram of multiplex PCR product

2.2核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色體系的建立 對上述多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色后，EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV的檢測結(jié)果均為肉眼可見的紅色，而陰性對照為無色(圖2)，表明成功建立了多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)對腦炎腦膜炎病毒進(jìn)行檢測。

注：2、4、6、8、10為EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV陽性標(biāo)本納米金檢測結(jié)果；1、3、5、7、9為EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV陰性對照納米金檢測結(jié)果2, 4, 6, 8, 10 are results of chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles for EEEV, WEEV, WNV, NiPA and JEV positive samples; 1, 3, 5, 7, 9 are results of chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles for EEEV, WEEV, WNV, NiPA and JEV negative control圖2 納米金顯色結(jié)果Fig.2 Results of chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles

2.3特異性檢測結(jié)果 腦炎腦膜炎病毒EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV在采用多重PCR反應(yīng)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)進(jìn)行檢測后只有對應(yīng)核酸侵入反應(yīng)探針的檢測體系為陽性，其余侵入反應(yīng)體系均為陰性。其他病毒如TBEV、StLEV、CHIKV和DV在上述所有核酸侵入反應(yīng)體系中均為陰性(表3)，表明本方法用于檢測腦炎腦膜炎病毒具有較高特異性。

2.4敏感性檢測結(jié)果 多重PCR反應(yīng)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色敏感性檢測結(jié)果顯示，該方法檢測EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV病毒最低檢測限為103拷貝/μL(圖3)。

2.5臨床標(biāo)本檢測結(jié)果 采用多重PCR反應(yīng)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)檢測15份臨床血清標(biāo)本,檢測結(jié)果均為乙型腦炎病毒陽性。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對,擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中流行性乙型腦炎病毒基因同源性均達(dá)到98%以上。

A、B、C、D、E分別為EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV敏感性檢測結(jié)果示意圖；檢測限從左至右依次為：1，10，100，1 000，10 000拷貝/μLA, B, C, D, E are result of sensitivity test for EEEV, WEEV, WNV, NiPA and JEV; Detection limits are 1, 10, 100, 1 000, 10 000 copies/μL from left to right圖3 敏感性檢測結(jié)果Fig.3 Result of sensitivity test

表3 多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)檢測腦炎腦膜炎病毒特異度結(jié)果
Tab.3 Specificity of multiplex PCR combined with invasive reaction and chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles in detection of encephalitis and meningitis virus

探針Probe病原體OrganismEEEVWEEVWNVNiPAJEVTBEVStLEVCHIKVDVEEEVprobe+--------WEEVprobe-+-------WNVprobe--+------NiPAprobe---+-----JEVprobe----+----

注：+ 表示檢測結(jié)果為陽性，- 表示檢測結(jié)果為陰性

Note: + positive result; - negative result

3 討 論

目前，東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、西尼羅病毒和尼帕病毒在我國尚未流行，但由于我國部分地區(qū)的地理、氣候、傳播媒介等條件與上述病毒流行區(qū)域——非洲、中、南美洲等地區(qū)相似，并且隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，全球貿(mào)易一體化等趨勢，每年數(shù)百萬人口出入疫區(qū)，在我國邊境口岸對來自疫區(qū)的人群、動物、禽類以及相關(guān)傳播媒介等開展檢測與檢疫，將有效防控上述病毒傳入我國[7]。由于這5種病毒的自然宿主和傳播媒介相同或者類似，臨床癥狀也大致相同，因此建立同時可檢測這5中病毒的快速檢測方法可顯著提高檢測效率，對于邊境口岸的檢測檢疫具有重要意義。

現(xiàn)有腦炎腦膜炎病毒實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)中，以病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫法和血清中和試驗(yàn)為主。這些方法存在著所需時間過長，靈敏度較低等缺點(diǎn)。近年來，PCR檢測技術(shù)因其具有較好的敏感性和特異性，在各種分子診斷中得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展，但基本都是用于單種病毒檢測(如乙型腦炎病毒)而難以對未知病原感染病例做出快速準(zhǔn)確診斷。而多重PCR檢測技術(shù)因其快速、簡便和高通量等特點(diǎn)，在病毒檢測中得到廣泛應(yīng)用[8-10]，但其缺點(diǎn)是操作繁瑣，需要電泳設(shè)備，而且很難區(qū)分與目的條帶大小接近的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。將多重PCR與核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)聯(lián)用，可利用納米金顯色技術(shù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行肉眼觀察，不像其他方法通過檢測電泳條帶和熒光信號等衍生變化來確定PCR反映結(jié)果。因此，多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)在檢測多重靶點(diǎn)上具有較明顯的優(yōu)勢。

本研究采用多重PCR技術(shù)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色來檢測腦炎腦膜炎病毒，檢測反應(yīng)整體共分為3個階段，首先進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)模板的擴(kuò)增；接著采用核酸侵入反應(yīng)[11-14]進(jìn)行核酸侵入信號放大，將目標(biāo)模板的檢測轉(zhuǎn)化為信號分子的檢測，并實(shí)現(xiàn)檢測信號放大；最后進(jìn)行納米金探針雜交反應(yīng)[6]，實(shí)現(xiàn)對信號分子的檢測。多重PCR技術(shù)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)可以同時檢測多種腦炎腦膜炎病毒，無需電泳設(shè)備，肉眼即可觀察結(jié)果，避免了在電泳過程中出現(xiàn)交叉污染，當(dāng)不同病原體擴(kuò)增的核酸片段大小沒有明顯差異，仍然可以鑒定病原體種類。

本實(shí)驗(yàn)針對EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV保守區(qū)基因進(jìn)行多重PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳檢測顯示在預(yù)測位置上均出現(xiàn)單一的目的條帶，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色，檢測結(jié)果顯示各個樣本的陽性顯色結(jié)果均為肉眼可見的紅色，而陰性對照為無色，待測樣本只有采用相應(yīng)的引物探針時，納米金顯色后才會顯示陽性，對于其他腦炎腦膜炎病毒如TBEV、StLEV、CHIKV和DV檢測結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。對EEEV、WEEV、WNV、NiPA和JEV采用該方法進(jìn)行檢測時，檢測限為1 000拷貝/μL。采用上述方法檢測乙型腦炎患者血清標(biāo)本時,檢測結(jié)果均為陽性。上述結(jié)果表明：多重PCR技術(shù)結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色方法可以同時檢測多種不同腦炎腦膜炎病毒，當(dāng)不同病原體擴(kuò)增的核酸片段大小沒有明顯差異時，仍然可以鑒定病原體種類，并且避免了毛細(xì)管電泳過程中容易出現(xiàn)的交叉污染，肉眼即可觀察結(jié)果，具有較高的特異性和敏感性。此外，本方法不需要配備昂貴的儀器，通過肉眼即可觀察檢測結(jié)果，成本低廉。而且在核酸侵入反應(yīng)不依賴核酸序列，而只依賴核酸形成的特異性結(jié)構(gòu)，并且由于該反應(yīng)并非擴(kuò)增待測模板本身，極大的降低了模板交叉污染的風(fēng)險, 可投入臨床使用。

綜上所述，多重PCR結(jié)合核酸侵入反應(yīng)及納米金顯色技術(shù)檢測腦炎腦膜炎病毒的方法，具有較高的檢測特異性及靈敏度，檢測通量高，肉眼即可觀察結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了上述幾種腦炎腦膜炎病毒進(jìn)行檢測，而在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)需要對多重PCR引物及引物探針進(jìn)行調(diào)整或增加，從而促進(jìn)本方法在更多腦炎腦膜炎病毒檢測方面的應(yīng)用，為口岸防范外來傳染病預(yù)警措施提供幫助。

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ApplicationofmultiplexPCRcombinedwithinvasivereactionandchromogenicreactioncatalyzedbygoldnanoparticlesindetectionofencephalitisandmeningitisvirus

FAN Huan, QI Yu-hua, ZHU Zheng, CUI Lun-biao, GE Yi-yue, ZHAO Kang-cheng,WU Tao，SHI Zhi-yang

(InstituteofPathogenMicrobiology,JiangsuProvincialCenterforDiseasePreventionandControl,KeyLaboratoriesofEntericPathogenicMicrobiology,MinistryofHealth,Nanjing210009,China)

We developed a method for detecting encephalitis and meningitis virus by using multiplex PCR combined with invasive reaction and a chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles. Primers were designed based on the conservative regions of encephalitis and meningitis virus (Eastern equine encephalitis virus, EEEV; Western equine encephalomyelitis virus, WEEV; West Nile virus, WNV; Nipah virus, NiPA; Japanese encephalitis virus, JEV). Multiplex PCR system, invasive reaction and a chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles were established to detect different encephalitis and meningitis virus in one reaction. Tick-borne encephalitis virus (TBEV), St Louis encephalitis virus (StLEV), Chikungunya virus(CHIKV) and Dengue virus(DV) were used to test its specificity. Quantitative RNA transcribedinvitroand PCR fragments were used to assess its sensitivity. Clinical specimens collected from JEV patients were detected by this method. A method for detecting encephalitis and meningitis virus by using multiplex PCR, invasive reaction and a chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles were successfully established. This method can detect targeted pathogens specifically, and it has no cross reaction with TBEV, StLEV, CHIKV and DV. The detecting limitation for different targets was 103copies/μL. Clinical samples were positive for JEV nucleic acids for above assay. The method presented here has characteristic of high specificity, sensitivity and throughput. The results can be observed by visual inspection. This method has broad application prospects in pathogen detection.

encephalitis and meningitis virus; multiplex PCR; invasive reaction; chromogenic reaction catalyzed by gold nanoparticles

Shi Zhi-yang, Email: shizhiyang@jscdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.008

艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)(No.2013ZX10004103)資助

史智揚(yáng),Email：shizhiyang@jscdc.cn

衛(wèi)生部腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所,南京 210009

R373.3

A

1002-2694(2017)11-0991-05

Supported by Grand Science and Technology Special Program “AIDS and Viral Hepatitis and Other Major Infectious Diseases Prevention and Control” (No.2013ZX10004103)

2017-03-02編輯梁小潔