段煉，黃柳明，劉鋼，封志純

(陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院，北京100700)

成人脂肪干細(xì)胞的體外多向分化能力觀察

段煉，黃柳明，劉鋼，封志純

(陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院，北京100700)

目的觀察成人脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的體外多向分化能力。方法從正常成人脂肪組織分離得到ADSCs并體外培養(yǎng)。在ADSCs中分別加入成人脂肪、骨、軟骨、肝細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化，誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)1周、誘導(dǎo)2周時(shí)采用RT-PCR法觀察細(xì)胞相應(yīng)標(biāo)志物mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果ADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)2周，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)空泡聚集，小脂滴融合在一起并變大；最后細(xì)胞變?yōu)閱畏?，并且充滿脂質(zhì)，紅油O染色陽(yáng)性；誘導(dǎo)1周細(xì)胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達(dá)較誘導(dǎo)前增加；誘導(dǎo)2周細(xì)胞PPARγ、脂蛋白酶mRNA表達(dá)降低，但αP2 mRNA變化不明顯。ADSCs向骨細(xì)胞誘導(dǎo)5天，細(xì)胞由成纖維形轉(zhuǎn)化為多邊形或不規(guī)則狀。誘導(dǎo)2周單層細(xì)胞聚集成塊，形成細(xì)胞島狀結(jié)構(gòu)，ALP染色陽(yáng)性，von Kossa染色可見黑色礦化結(jié)節(jié)；礦化結(jié)節(jié)形成后細(xì)胞向結(jié)節(jié)移行聚集，促使更多的細(xì)胞形成更大的礦化結(jié)節(jié)；誘導(dǎo)后細(xì)胞ALP、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)逐漸增加。ADSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)1周，細(xì)胞呈多邊形或類圓形，細(xì)胞團(tuán)向內(nèi)呈放射狀聚集，F(xiàn)ITC染色后免疫熒光可見Ⅱ型膠原；誘導(dǎo)1、2周時(shí)細(xì)胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達(dá)明顯高于誘導(dǎo)前。ADSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)2周時(shí)可見部分細(xì)胞變成圓形或橢圓形，并隨時(shí)間順延呈肝細(xì)胞樣圓形細(xì)胞增多趨勢(shì)，細(xì)胞核居中，圓形且邊緣清楚，PAS染色陽(yáng)性；誘導(dǎo)1、2周時(shí)細(xì)胞CK18、HNF1α及白蛋白mRNA表達(dá)明顯高于誘導(dǎo)前。結(jié)論成人脂肪組織中分離得到的成人ADSCs可在體外定向分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肝細(xì)胞。

成人脂肪干細(xì)胞；體外誘導(dǎo)；多向分化；脂肪細(xì)胞；骨細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；肝細(xì)胞

干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，是組織工程的基礎(chǔ)。目前干細(xì)胞主要來(lái)源于各種組織，如肌肉、骨髓、臍血或胚胎等。相對(duì)于上述來(lái)源的干細(xì)胞，脂肪來(lái)源的干細(xì)胞由于其取材安全、簡(jiǎn)單，在人體內(nèi)儲(chǔ)量豐富，更少牽扯倫理、道德、法律方面的問(wèn)題，并且同樣具有高增殖性和多向分化能力，在組織工程領(lǐng)域中的作用舉足輕重[1]。有研究證實(shí)，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)被誘導(dǎo)后能表達(dá)成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞基因和蛋白標(biāo)志，即分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。但目前有關(guān)ADSCs分化能力的研究?jī)H限于動(dòng)物[2]。2013年9月～2016年9月，本研究觀察了成人ADSCs的體外多向分化能力?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮的正常人體腹部脂肪組織5 cm×5 cm×5 cm，取自一名年齡35歲的男性抽脂患者，患者已簽署知情同意書。成脂肪的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰島素，200 μmol/L消炎痛，0.5 μmol/L 3-異丁基-甲基黃嘌呤，1%抗生素以及谷氨酰胺)。成骨的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，0.1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L β-磷酸甘油鈉，50 μmol/L維生素C，0.01 μmol/L 1，25-二羥維生素D3，1%抗生素)。成軟骨的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，100 μmol/L地塞米松，6.25 μg/mL胰島素，50 μmol/L維生素C，110 μg/mL丙酮酸鈉，1%抗生素)。成肝細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，20 ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10 ng/mL基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，4.9 μmol/L尼克酰胺，20 ng/mL制瘤素M，100 μmol/L胰島素，6.25 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，3.6 μmol/L亞硒酸，190 μmol/L亞油酸，1%抗生素)。鼠抗人 CD29、CD44 和HLA-DR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 成人ADSCs分離及鑒定 將人脂肪組織剪碎移入0.075%膠原酶Ⅱ溶液中，37 ℃水浴30 min。將所得細(xì)胞懸液用細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后以1×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。每72 h換液(10%FBS的DMEM培養(yǎng)液)1次。貼壁細(xì)胞融合達(dá)90%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板，72 h換液1次。第3代細(xì)胞加入熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD29、CD44和HLA-DR孵育30 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示CD29和CD44表達(dá)均為陽(yáng)性，而HLA-DR不表達(dá)，證實(shí)為脂肪干細(xì)胞[3]。

1.3 ADSCs向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代ADSCs細(xì)胞，消化制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液24 h，加入成脂肪的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基1次。每日取所得細(xì)胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，60%異丙醇+1%紅油O密閉染色10 min，60%異丙醇分色，70%乙醇洗去多余染色劑，再用蒸餾水洗滌數(shù)次，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)1、2周采用RT-PCR法檢測(cè)過(guò)氧化酶增殖激活受體γ(PPARγ)、脂蛋白酶和脂肪酸結(jié)合蛋白4(αP2)mRNA。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參照，PCR引物電泳拍照觀察各標(biāo)志物mRNA表達(dá)。

1.4 ADSCs向骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 誘導(dǎo)方法同1.3，誘導(dǎo)過(guò)程中加成骨的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每日取所得細(xì)胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，緩沖液沖洗后行ALP染色和von Kossa染色，光鏡下觀察。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)1、2周采用RT-PCR法檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況的變化。

1.5 ADSCs向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 誘導(dǎo)方法同1.3，誘導(dǎo)過(guò)程中加成軟骨的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每日取所得細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，PBS反復(fù)沖洗后使用鼠抗人Ⅱ型膠原染色，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，使用羊抗鼠IgG-FITC染色1 h，PBS反復(fù)沖洗后使用免疫熒光顯微鏡觀察。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)1、2周采用RT-PCR法檢測(cè)Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA。操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以GAPDH為內(nèi)參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標(biāo)志物mRNA表達(dá)。

1.6 ADSCs向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定 誘導(dǎo)方法同1.3，誘導(dǎo)過(guò)程中加成軟骨的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每日取所得細(xì)胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，用過(guò)碘酸行PAS染色，光鏡下觀察。分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)1、2周采用RT-PCR法檢測(cè)CK18、肝細(xì)胞核因子1α(HNF1α)、白蛋白mRNA。以GAPDH為內(nèi)參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標(biāo)志物mRNA表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果 誘導(dǎo)24 h后可見細(xì)胞變圓，體積增大，胞內(nèi)有少量脂滴形成，脂質(zhì)空泡小并且大多位于細(xì)胞核旁。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴的數(shù)量和體積增加，ADSCs逐漸變?yōu)槎喾康闹炯?xì)胞。誘導(dǎo)2周，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)空泡聚集，小脂滴融合在一起并變大；最后細(xì)胞變?yōu)閱畏?，并且與成熟的脂肪細(xì)胞一樣充滿脂質(zhì)。紅油O染色陽(yáng)性。誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)1周、誘導(dǎo)2周細(xì)胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達(dá)情況見圖1。誘導(dǎo)1周細(xì)胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達(dá)較誘導(dǎo)前增加；誘導(dǎo)2周細(xì)胞PPARγ、脂蛋白酶mRNA表達(dá)降低，但αP2 mRNA變化不明顯。見圖1A。

2.2 ADSCs向骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果 誘導(dǎo)5天細(xì)胞由成纖維形轉(zhuǎn)化為多邊形或不規(guī)則狀。2周后單層細(xì)胞聚集成塊，形成細(xì)胞島狀結(jié)構(gòu)。ALP染色陽(yáng)性，von Kossa染色可見黑色礦化結(jié)節(jié)。礦化結(jié)節(jié)形成后，細(xì)胞向結(jié)節(jié)移行聚集，促使更多的細(xì)胞形成更大的礦化結(jié)節(jié)。誘導(dǎo)后細(xì)胞ALP、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)逐漸增加。見圖1B。

2.3 ADSCs向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果 誘導(dǎo)1周細(xì)胞呈多邊形或類圓形，細(xì)胞團(tuán)向內(nèi)呈放射狀聚集。FITC染色后免疫熒光可見Ⅱ型膠原。誘導(dǎo)1、2周細(xì)胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達(dá)明顯高于誘導(dǎo)前。見圖1C。

2.4 ADSCs向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化結(jié)果 誘導(dǎo)2周可見部分細(xì)胞變成圓形或橢圓形，并隨時(shí)間順延呈肝細(xì)胞樣圓形細(xì)胞增多趨勢(shì)。細(xì)胞核居中，圓形且邊緣清楚。PAS染色陽(yáng)性。誘導(dǎo)1、2周細(xì)胞CK18、HNF1α及白蛋白mRNA表達(dá)明顯高于誘導(dǎo)前。見圖1D。

注：A為脂肪細(xì)胞；B為骨細(xì)胞；C為軟骨細(xì)胞；D為肝細(xì)胞。

圖1ADSCs向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞誘導(dǎo)前后相應(yīng)標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況

3 討論

組織工程的目的在于修復(fù)受損的組織器官功能。保持充足的細(xì)胞供給和可變的細(xì)胞采集來(lái)源，是細(xì)胞治療的基礎(chǔ)。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域最重要的細(xì)胞來(lái)源，但其在分離培養(yǎng)過(guò)程中存在著諸多缺陷[4]。脂肪組織由胚胎間充質(zhì)生成，相對(duì)于由造血細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞混合組成的骨髓干細(xì)胞而言，脂肪組織分離的干細(xì)胞具有更大的細(xì)胞同質(zhì)性，在誘導(dǎo)過(guò)程中更能保證分化細(xì)胞的一致性，減少了細(xì)胞致畸、致瘤等可能；脂肪組織來(lái)源充足，獲取更容易，累及脂肪組織的疾病發(fā)病率很低[5]。因此，ADSCs應(yīng)是一種比骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞更理想的組織工程種子來(lái)源[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs的分離效率高于其他干細(xì)胞。有文獻(xiàn)選用NH4Cl裂解紅細(xì)胞[7]，這樣可能會(huì)影響分離得到的干細(xì)胞質(zhì)量。本研究我們選擇使用細(xì)胞濾網(wǎng)去除消化后殘余的血管、紅細(xì)胞以及膠原纖維等雜質(zhì)，大大減少了培養(yǎng)基中紅細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的數(shù)量；同時(shí)選用0.075%Collagenase Ⅱ 37 ℃水浴30 min，節(jié)約了所用酶量和酶解時(shí)間。體外培養(yǎng)ADSCs的條件也較簡(jiǎn)單，在加有任何批號(hào)FBS的DMEM培養(yǎng)基中均能很好地?cái)U(kuò)增；ADSCs平均倍增時(shí)間為60 h，并能穩(wěn)定傳代10～15代。表明ADSCs體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下呈高增殖率。ADSCs表達(dá)CD29和CD44，顯示其具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性[8]；而其MHC Ⅱ相關(guān)蛋白HLA-DR不表達(dá)，說(shuō)明它們極少表達(dá)與移植排斥相關(guān)的抗原分子，提示ADSCs具有免疫逃逸特性，可能進(jìn)行同種異體移植。

ADSCs在成脂肪誘導(dǎo)過(guò)程中，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集、融合并變大，能特異性將脂滴染成紅色的油紅O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性[9]；同時(shí)向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)PPARγ、脂蛋白酶、αP2 mRNA，說(shuō)明誘導(dǎo)后細(xì)胞已具有脂肪細(xì)胞特性。

成骨細(xì)胞的基本標(biāo)志是能分泌ALP和鈣鹽[10]。本研究結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)1～2周，可以觀察到礦化結(jié)節(jié)，細(xì)胞von Kossa染色呈陽(yáng)性，證實(shí)分化細(xì)胞分泌鈣鹽并有鈣沉積；ALP染色陽(yáng)性說(shuō)明經(jīng)成骨誘導(dǎo)后的ADSCs已具有成骨細(xì)胞特征。RT-PCR結(jié)果顯示，向骨細(xì)胞誘導(dǎo)后的細(xì)胞ALP、骨橋蛋白和I型膠原mRNA表達(dá)增加。骨橋蛋白是成骨作用的重要信號(hào)[11]，在誘導(dǎo)過(guò)程中的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)可以證實(shí)成骨作用發(fā)生，誘導(dǎo)后的細(xì)胞已有骨細(xì)胞特性。

軟骨的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)主要由Ⅱ型膠原構(gòu)成，聚集蛋白聚糖在軟骨中起抗壓以及維持軟骨彈性的作用，Sox9則在軟骨生成中促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞凝集[12～14]。本研究結(jié)果顯示，向軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原，RT-PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞Ⅱ型膠原纖維、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達(dá)增加，證實(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞特征。

本研究PAS染色結(jié)果證實(shí)，向肝細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞糖原貯積，RT-PCR結(jié)果顯示ADSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)2周后，CK18、HNF1α和白蛋白mRNA表達(dá)增加，說(shuō)明誘導(dǎo)后的細(xì)胞已具有肝細(xì)胞功能。

綜上所述，成人脂肪組織能夠分離培養(yǎng)出ADSCs，其在體外具有多向分化的潛能，并且不具有免疫原性[15]。基于上述理由，我們認(rèn)為ADSCs可以成為干細(xì)胞的新來(lái)源，其在組織工程的臨床應(yīng)用方面具有重要作用。

[1] Han SF， Wang B， Li X, et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional culture promote neuronal regeneration by neurotrophic protection and immunomodulation[J].J Biomed Mater Res, 2016,104(7):1759.

[2] Li L， Jaiswal PK， Makhoul G, et al. Hypoxia modulates cell migration and proliferation in placenta-derived mesenchymal stem cells[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2017,154(2):543-552.

[3] 段煉，宋智鋼,徐志云，等.成人脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J].解剖學(xué)雜志，2009，32(4)：448-450.

[4] Kim SH.Comparison of microRNA expression in placenta-derived mesenchymal stem cells and bone marrow-derived stem cells[J]. J Life Sci, 2014,24(11):1238-1243.

[5] Takemitsu H, Zhao D, Yamamoto I, et al. Comparison of bone marrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells[J]. BMC Vet Res, 2012(8):150.

[6] Park YH， Jung KJ， Song IH. The effects of bone marrow derived-mesenchymal stem cells in adriamycin induced nephropathy in the rat[J]. Pediat Nephrol, 2014,29(12):2430-2430.

[7] Sarhan M， El SH， Hussein AM, et al. Impact of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells on adriamycin-induced chronic nephropathy[J]. Canadian J Physio Pharmacol, 2014,92(9):733.

[8] Peroni D, Scambi I, Pasini A, et al. Stem molecular signature of adipose-derived stromal cells[J]. Exp Cell Res, 2008,314(3):603-615.

[9] Ghasemi A， Mamdouh F， Gholami F, et al. Evaluation of therapeutic effects of autologous bone marrow mesenchymal stem cells to prevent the progression of chronic nephropathy in renal transplant[J]. Inter J Pediat, 2014,2(2-3):740-744.

[10] Darling EM, Topel M, Zauscher S, et al. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells andprimary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes[J]. J Biomech, 2008,41(2): 454-464.

[11] Anan HH， Zidan RA， Shaheen MA, et al.Therapeutic efficacy of bone marrow derived mesenchymal stromal cells versus losartan on adriamycin-induced renal cortical injury in adult albino rats[J]. Cytotherapy, 2016,18(8):970.

[12] Embaby AS， Metwally HG. Histological comparative study between endogenous and therapeutic stem cells in adriamycin-induced renal cortical toxicity in male rats[J]. Egy J Histol, 2015,38(4):721-731.

[13] Chung CS, Fujita N, Kawahara N, et al. A comparison of neurosphere differentiation potential of canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells and adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. J Veterin Med Sci, 2013,75(7):879.

[14] Zoja C, Garcia PB, Rota C, et al. Mesenchymal stem cell therapy promotes renal repair by limiting glomerular podocyte and progenitor cell dysfunction in adriamycin-induced nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2012,303(9):1370.

[15] Vishnubalaji R, Al-Nbaheen M, Kadalmani B, et al. Comparative investigation of the differentiation capability of bone-marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells by qualitative and quantitative analysis[J]. Cell Tissue Res, 2012,347(2):419-427.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500391)。

封志純(E-mail： zhjfengzc@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.011

R318

A

1002-266X(2017)40-0038-04

2016-10-10)