任琦，孫淑豐，李玉紅，朱凌妍，牛琛，馮福民

(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063210)

ADLI大鼠肝組織DNA羥甲基化變化及其機(jī)制

任琦，孫淑豐，李玉紅，朱凌妍，牛琛，馮福民

(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063210)

目的探討抗結(jié)核藥物性肝損傷(ADLI)形成過程中DNA羥甲基化變化及其機(jī)制。方法選擇SD大鼠96只，隨機(jī)分為異煙肼組、對照組各48只。異煙肼組給予異煙肼55 mg/(kg·d)灌胃，對照組給予等體積蒸餾水灌胃。兩組分別于灌胃3、7、10、14、21、28天各隨機(jī)取8只，麻醉后心臟取血，檢測血漿ALT、AST；處死后留取肝組織，HE染色，觀察肝組織病理變化；采用RT-PCR法檢測肝組織谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)基因C、甲基胞嘧啶(5mC)、氧化成羥甲基胞嘧啶(5hmC)含量；采用ELISA法檢測肝組織10-11易位蛋白1(TET1)蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測TET1 mRNA表達(dá)。結(jié)果隨著給藥時(shí)間延長，異煙肼組肝損傷程度逐漸加重；其GSTP1基因C含量隨著肝損傷程度加重呈下降趨勢，而5mC含量先上升，至灌胃14天略有回落，隨后繼續(xù)上升；5hmC含量呈現(xiàn)下降趨勢，至灌胃21天降至最低，灌胃28天時(shí)略有回升；而TET1蛋白水平及其mRNA表達(dá)與5hmC含量變化基本一致。結(jié)論DNA羥甲基化可能參與了ADLI的發(fā)生。

藥物性肝損傷；異煙肼；DNA甲基化；DNA羥甲基化；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1；10-11易位蛋白

異煙肼是WHO推薦的一線抗結(jié)核藥物，但長期應(yīng)用可導(dǎo)致抗結(jié)核藥物性肝損傷(ADLI)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在ADLI發(fā)生、發(fā)展過程中常伴有DNA甲基化異常表達(dá)[2]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)在抗結(jié)核藥物的代謝及肝臟解毒過程中發(fā)揮重要作用，其啟動子區(qū)CpG島甲基化異?？赡軈⑴cADLI的發(fā)生[3]。以往認(rèn)為，DNA甲基化是一個(gè)非常穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)改變，但隨著DNA羥甲基化的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸意識到甲基化過程是動態(tài)可逆的，并認(rèn)為羥甲基化可能參與DNA去甲基化過程[4]。在這一過程中，10-11易位(TET)蛋白家族發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[5]。TET家族蛋白共有TET1、TET2、TET3三種亞型，在二價(jià)鐵離子和α-酮戊二酸依賴性氧化酶的共同作用下，TET家族蛋白可將甲基胞嘧啶(5mC)氧化成羥甲基胞嘧啶(5hmC)，且在胸腺嘧啶DNA糖基化酶和去甲基酶的共同作用下，5hmC可通過堿基切除修復(fù)進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)5mC修飾[6]。因此，5hmC可能是DNA去甲基化過程的中間產(chǎn)物和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2015年9月～2016年6月，我們觀察了異煙肼致ADLI大鼠肝組織GSTP1基因胞嘧啶(GSTP1基因C)、5mC、5hmC和TET1蛋白及其mRNA表達(dá)變化，現(xiàn)分析結(jié)果，旨在探討ADLI的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠96只，SPF級，雌雄各半，8～9周齡，體質(zhì)量258～365 g，異煙肼(沈陽紅旗制藥有限公司，規(guī)格：100 mg/片)。全自動生化分析儀(日本日立公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Thermo Fisher Scientific公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD公司)；熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。TRI pure Reagent 總RNA抽提試劑盒和TET1 ELISA試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；Platinum SYBR Green qPCR試劑盒、莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)試劑盒(美國Invitrogen公司)；DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；5mC-5hmC分析試劑盒(美國NEB公司)。

1.2 動物分組及ADLI模型制備 隨機(jī)將96只大鼠分為異煙肼組和對照組，每組48只。異煙肼組參照查月芳等[7]的方法建立ADLI模型，即以異煙肼55 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃；對照組同期給予等體積蒸餾水連續(xù)灌胃。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 兩組分別于灌胃3、7、10、14、21、28天各隨機(jī)取8只大鼠，麻醉后心臟取血，分離血漿，-40 ℃保存；處死后留取肝組織，-80 ℃保存。觀察以下指標(biāo)。

1.3.1 肝損傷情況 ①血漿ALT、AST水平：采用全自動生化分析儀以速率法檢測血漿ALT、AST。②肝組織病理變化：取部分肝組織，4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.3.2 肝組織GSTP1基因C、5mC、5hmC表達(dá) 取肝組織50 mg，剪碎，提取肝組織DNA后，PCR擴(kuò)增獲得GSTP1基因片段。GSTP1上游引物：5′-CATCCTTCCACGCACATCCTC-3′，下游引物：5′-CGTTACTTGGCTGGTTGATGTC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGACTAGCAAGCAGGAGT-3′，下游引物：5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，65 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)。根據(jù)5mC-5hmC分析試劑盒說明檢測GSTP1基因C、5mC和5hmC相對表達(dá)量[8]。

1.3.3 肝組織TET1蛋白和mRNA表達(dá) ①TET1蛋白表達(dá)：采用ELISA法。取肝組織50 mg，超聲破碎，制成1∶5組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL；樣本孔先加待測樣本10 μL，然后加入樣本稀釋液40 μL。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入檢測抗體100 μL后，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去各孔中液體，加入洗滌液重復(fù)洗板5次后，分別加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL反應(yīng)15 min，檢測各孔光密度(OD)值。②TET1 mRNA表達(dá)：采用RT-PCR法。取肝組織50 mg，TRIzol法提取組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)M-MLV試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：TET1上游引物：5′-TGGCCAGAAGGGAAAAGCAA-3′，下游引物：5′-TAATCACCCACTTGGCGACC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGACTAGCAAGCAGGAGT-3′，下游引物：5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，退火至4 ℃，-20 ℃保存。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TET1 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝損傷情況比較 ①血漿ALT、AST水平：見表1。②肝組織病理變化：灌胃3天，兩組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)相似，肝細(xì)胞以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞界限清晰，無炎癥改變。灌胃7天，異煙肼組肝小葉周圍肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞腫大；灌胃10天肝細(xì)胞腫大更明顯，由多角形變?yōu)榍蛐?，且伴有溶解性壞死；灌?4天肝細(xì)胞胞質(zhì)呈彌漫性疏松化，氣球樣；灌胃21天可見肝細(xì)胞溶解壞死，出現(xiàn)雙核細(xì)胞；灌胃28天可見點(diǎn)狀壞死灶及纖維組織增生。對照組灌胃7、10、14、21、28天與灌胃3天比較未見明顯變化。

表1 兩組不同時(shí)間血漿ALT、AST水平比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組灌胃3天比較，#P<0.05；與同組灌胃7天比較，△P<0.05；與同組灌胃10天比較，▲P<0.05；與同組灌胃14天比較，▽P<0.05；與同組灌胃21天比較，▼P<0.05。

2.2 兩組不同時(shí)間肝組織GSTP1基因C、5mC和5hmC相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 兩組不同時(shí)間肝組織GSTP1基因C、5mC和5hmC相對表達(dá)量比較(%)

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組灌胃3天比較，#P<0.05；與同組灌胃7天比較，△P<0.05；與同組灌胃10天比較，▲P<0.05；與同組灌胃14天比較，▽P<0.05；與同組灌胃21天比較，▼P<0.05。

2.3 兩組不同時(shí)間肝組織TET1相對表達(dá)量比較 見表3。

3 討論

DNA甲基化可通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，改變相關(guān)基因的表達(dá)，繼而引起某些疾病[9]。

表3 兩組不同時(shí)間肝組織TET1表達(dá)比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組灌胃3天比較，#P<0.05；與同組灌胃7天比較，△P<0.05；與同組灌胃10天比較，▲P<0.05；與同組灌胃14天比較，▽P<0.05；與同組灌胃21天比較，▼P<0.05。

Kovalenko等[10]研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度吡嗪酰胺飼養(yǎng)的Wistar大鼠肝組織可出現(xiàn)不同程度損傷，其肝臟全基因組甲基化降低，GSTP1基因啟動子區(qū)出現(xiàn)超甲基化改變，提示GSTP1基因DNA甲基化可能參與了ADLI的發(fā)生、發(fā)展。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族(GSTs)是參與許多藥物Ⅱ相代謝所必需的催化酶，在生物解毒過程中發(fā)揮重要作用。GSTP1是GSTs的重要一員，存在于其5號外顯子區(qū)域的突變位點(diǎn)，可使第105位氨基酸由異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，這一改變可降低酶的催化活性，繼而影響其解毒功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化可抑制其相關(guān)蛋白的表達(dá)，在肝癌早期即已存在這種改變，并通過這種方式影響肝損傷及肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1基因啟動子區(qū)高甲基化者比低甲基化者發(fā)展為ADLI的危險(xiǎn)性更高，提示ADLI的發(fā)生與GSTP1基因高甲基化表達(dá)密切相關(guān)[13]。TET1蛋白作為一種羥化酶，能夠?qū)?mC催化成5hmC，從而精密地調(diào)控基因組甲基化和去甲基化平衡[14]。但5hmC作為去甲基化過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和中間產(chǎn)物，在ADLI發(fā)展過程中的研究鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，異煙肼組隨著給藥時(shí)間的延長，肝損傷程度逐漸加重；其GSTP1基因C含量隨著肝損傷程度加重呈下降趨勢，而5mC含量先上升，至灌胃14天略有回落，隨后繼續(xù)上升；5hmC含量呈現(xiàn)下降趨勢，至灌胃21天降至最低，灌胃28天時(shí)略有回升。說明隨著肝損傷程度加重，GSTP1基因甲基化水平升高，而羥甲基化水平下降。TET1蛋白是將5mC催化為5hmC的關(guān)鍵蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)， TET1蛋白及mRNA表達(dá)與5hmC的變化趨勢基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。

綜上所述， DNA羥甲基化可能參與了ADLI的發(fā)生。但本研究觀察時(shí)間較短，今后研究中需適當(dāng)延長觀察時(shí)間，以便進(jìn)一步明確ADLI與DNA甲基化和羥甲基化的關(guān)系。

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馮福民(E-mail: fm_feng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.009

R575.1

A

1002-266X(2017)40-0032-03

2016-09-21)