粟倩雅 林彤 張孟麗 彭霖

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院激光科（第一作者現(xiàn)在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚科，210009南京）

·論著·

原代人黑素細(xì)胞Wnt5A基因沉默的研究

粟倩雅 林彤 張孟麗 彭霖

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院激光科（第一作者現(xiàn)在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚科，210009南京）

目的 優(yōu)化Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)條件，建立沉默Wnt5A基因的模型。方法 培養(yǎng)原代人黑素細(xì)胞，將不同濃度（0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L）的陽(yáng)性參照基因GAPDH特異性siRNA通過(guò)脂質(zhì)體法介導(dǎo)轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）篩選轉(zhuǎn)染效率最高的siRNA濃度；合成3條Wnt5A-siRNA（Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743），分別轉(zhuǎn)染原代人表皮黑素細(xì)胞，qPCR法選擇干擾特異性最佳的Wnt5A-siRNA；用最佳Wnt5A-siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48、72 h提取總mRNA及總蛋白，通過(guò)qPCR及Western印跡法確定轉(zhuǎn)染效率最高的時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞后，GAPDH mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.009±0.161、0.086±0.010、0.140±0.016、0.285±0.095、0.012±0.007，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.469，P ＜ 0.05）。60 nmol/L siRNA組GAPDH表達(dá)低于其他各組（均P＜0.05），干擾效率最佳；各Wnt5A-siRNA組及空白組Wnt5A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7 006.094，P＜0.05）。Wnt5A-siRNA-1743組目標(biāo)分子表達(dá)量低于其他3組（均P＜0.05），干擾效率最佳。Wnt5A-siRNA-1743轉(zhuǎn)染原代人表皮黑素細(xì)胞后24、48、72 h及空白組Wnt5A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.215，P ＜0.05），干擾后48 h低于干擾后24、72 h及空白組（均P ＜0.05）；Wnt5A蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為112.798±0.218、77.765±0.415、30.540±0.219、130.025±0.158，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79 122.889，P＜0.05），干擾后72 h低于干擾后24、48 h及空白組（均P＜0.05）。結(jié)論 成功建立siRNA沉默人黑素細(xì)胞Wnt5A基因的模型。

黑素細(xì)胞；RNA，小分子干擾；基因沉默；Wnt5A

用于介導(dǎo)小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染人細(xì)胞的方法有病毒介導(dǎo)法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、磷酸鈣法和顯微注射法［1］等。脂質(zhì)體具有和細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜相似的結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞相容性較高，所以脂質(zhì)體法是比較有前景的方法［2］。但在脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，其轉(zhuǎn)染效率會(huì)因質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例、細(xì)胞密度等的不同而有所差異，且脂質(zhì)體試劑還會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，引起細(xì)胞死亡，從而不易區(qū)分靶基因表達(dá)水平的降低是干擾作用還是細(xì)胞死亡的緣故。因此，有必要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得理想的轉(zhuǎn)染效果。本研究旨在用Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞，沉默Wnt5A基因，確定轉(zhuǎn)染效率最高的實(shí)驗(yàn)方法，建立基因特異性基因沉默模型，為黑素細(xì)胞的基因功能、分子通路等研究提供參考。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

Medium254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基、HMGS添加劑、分離酶（Protease type IX）、Opti-MEM培養(yǎng)基、完全1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）。cDNA合成試劑盒，脂質(zhì)體試劑Lipofectamine?3000（美國(guó)Thermo公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（美國(guó)Vazyme公司）。

二、方法

1.原代人黑素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：取男童包皮環(huán)切術(shù)后多余皮膚，聚維酮碘、磷酸鹽緩沖液沖洗。將皮膚組織剪成細(xì)長(zhǎng)條，放入2.5 g/L分散酶中4℃消化14～16 h。分離表皮與真皮，剪碎表皮，加入0.25%胰酶，0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）室溫下消化2～3 min，離心、棄上清液；用完全黑素培養(yǎng)基混懸沉淀物，接種于培養(yǎng)瓶中。24 h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，以后每2～3天換液1次。15～20 d后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，傳代純化培養(yǎng)。取第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

2.不同濃度陽(yáng)性參照GAPDH特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞：將細(xì)胞種到6孔板上，待細(xì)胞融合60%～70%時(shí)，各孔加入2 ml M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染體系如下：脂質(zhì)體試劑（Lipo）管加入Opti-MEM 117.5 μl、Lipo3000 7.5 μl，靜置 5 min；siRNA管加入Opti-MEM、GAPDH-siRNA（序列為5′-UGAC CUCAACUACAUGGUUTTAACCAUGUAGUUGAGG UCATT-3′）。第1～5組GAPDH-siRNA濃度分別設(shè)定為0（對(duì)照組）、20、33.3、40、60 nmol/L，所加入的GAPDH-siRNA分別為0、2.25、3.75、4.5、6.75 μl，以O(shè)pti-MEM培養(yǎng)基稀釋至總?cè)莘e125 μl，其中第3組為L(zhǎng)ipo3000說(shuō)明書推薦濃度。將siRNA加入脂質(zhì)體試劑中，室溫孵育10～15 min。最后將RNA-Lipo混合物加入對(duì)應(yīng)各細(xì)胞孔中。培養(yǎng)48 h提總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行qPCR：50℃ 2 min；95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào)；60℃～95℃緩慢升溫進(jìn)行熔解曲線分析。參照說(shuō)明書通過(guò)相對(duì)CT法檢測(cè)GAPDH的基因表達(dá)，計(jì)算各組GAPDH干擾效率。

3.Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞：將細(xì)胞種到6孔板上，待細(xì)胞融合60%～70%時(shí)，各孔加入2 ml M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染體系如下：Lipo管加入Opti-MEM 117.5 μl、Lipo3000 7.5 μl，靜置5 min；siRNA管加入Opti-MEM 118.25 μl、Wnt5A-siRNA 6.75 μl，混勻。Wnt5A-siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，分別是Wnt5A-siRNA-793（序列5′-GUGGUCGCUAGGUAUGAAUTTAUUCAUACC UAGCGACCACTT-3′）、Wnt5A-siRNA-943（序列 5′-CGCGAAGACAGGCAUCAAATTUUUGAUGCCUGU CUUCGCGTT-3′）、Wnt5A-siRNA-1743（序列 5′-GCUACGUCAAGUGCAAGAATTUUCUUGCACUUG ACGUAGCTT-3′）。將siRNA管加入脂質(zhì)體試劑管中，室溫孵育10～15 min。最后將RNA-Lipo混合物加入對(duì)應(yīng)各細(xì)胞孔中，培養(yǎng)48 h提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，行qPCR：50℃ 2 min；95℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40個(gè)循環(huán)后，采集熒光信號(hào)；60℃～95℃緩慢升溫進(jìn)行熔解曲線分析。參照說(shuō)明書通過(guò)相對(duì)CT法檢測(cè)Wnt5A基因表達(dá)，計(jì)算各組Wnt5A干擾效率。Wnt5A擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，正向引物為5′-CCTTCGCCCAGGTTGTAAT-3′，反向引物為5′-AGAGAGGCTGTGCTCCTATAA-3′。

4.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響：選取實(shí)驗(yàn)方法3中干擾特異性最佳的Wnt5A-siRNA轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞，轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)過(guò)程如方法3。分別培養(yǎng)24、48、72 h，提取mRNA及總蛋白，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過(guò)qPCR及Western印跡法，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。ImageJ軟件對(duì)所得條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶GAPDH相對(duì)灰度的比值，分析各時(shí)間點(diǎn)Wnt5A干擾效率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、GAPDH特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞

各濃度 GAPDH-siRNA 組（0、20、33.3、40、60 nmol/L）GAPDH mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.009±0.161、0.086 ± 0.010、0.140 ± 0.016、0.285 ± 0.095、0.012±0.007，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.469，P ＜0.05），60 nmol/L siRNA組GAPDH表達(dá)低于其他各組（q值分別為 20.517、1.523、2.635、5.606，均P ＜ 0.05），干擾效率最佳。

二、Wnt5A特異性siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞

Wnt5A-siRNA轉(zhuǎn)染原代人表皮黑素細(xì)胞后，Wnt5A-siRNA-793組、Wnt5A-siRNA-943組、Wnt5A-siRNA-1743組及空白組的Wnt5A mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7 006.094，P ＜ 0.05），Wnt5A-siRNA-1743組目標(biāo)分子表達(dá)量低于其他3組（q值分別為80.816、22.139、188.532，均P ＜ 0.05），干擾效率最佳。

三、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

Wnt5A-siRNA-1743轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24、48、72 h及空白組Wnt5A mRNA表達(dá)量分別為0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.215，P ＜0.05），干擾后48 h低于干擾后24 h、干擾后72 h及空白組（q值分別為12.042、4.453、1.261，均P ＜ 0.05）。干擾后24、48、72 h及空白組Wnt5A蛋白表達(dá)量分別為112.798 ± 0.218、77.765 ± 0.415、30.540 ± 0.219、130.025±0.158，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79 122.889，P ＜ 0.05），干擾后24、48、72 h蛋白表達(dá)率分別為對(duì)照組的86.75%、59.81%、23.49%，干擾效率分別為13.25%、40.19%、76.51%，干擾后72 h低于干擾后24 h、干擾后48 h及空白組（q值分別為637.114、526.792、302.305，均P ＜ 0.05）。培養(yǎng)48 h后對(duì)Wnt5A mRNA、72 h后對(duì)Wnt5A蛋白干擾效率最高。見圖1。

圖1 Wnt5A-siRNA轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)Wnt5A蛋白與陽(yáng)性參照GAPDH蛋白的表達(dá)量

討 論

為使Wnt5A在原代人黑素細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低，多種轉(zhuǎn)染媒介如慢病毒、腺病毒、shRNA、siRNA［3］等均可使用。病毒載體可實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但價(jià)格昂貴；siRNA較shRNA轉(zhuǎn)染效率相似，有效時(shí)間略短但成本更低，因此選擇siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于siRNA作用方式為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，有效時(shí)間在72～96 h內(nèi)，因此需要確定siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)mRNA和蛋白干擾效率最佳的時(shí)間。預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干擾效率最佳的時(shí)間在基因水平為48 h，蛋白水平為72 h。理論上可通過(guò)對(duì)目標(biāo)mRNA的分析，準(zhǔn)確找到siRNA的最佳作用位置，但這個(gè)過(guò)程十分耗時(shí)且昂貴?？尚械慕鉀Q方案是對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)3～4對(duì)siRNA，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的一段siRNA進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。由于siRNA直接作用于mRNA，檢測(cè)mRNA水平是最直接的指標(biāo)，因此在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們主要選擇qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

由于相關(guān)文獻(xiàn)［4-5］支持較少，siRNA成功轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞是本實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)。我們?cè)谠缙趪L試用Lipofectamine3000試劑盒推薦的體系來(lái)轉(zhuǎn)染3條siRNA，均未成功。于是選用陽(yáng)性參照GAPDH特異性siRNA來(lái)摸索適合于原代人黑素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系，選出干擾效率最高的濃度轉(zhuǎn)染后續(xù)目標(biāo)基因siRNA。GAPDH是實(shí)驗(yàn)常用的管家基因，作為陽(yáng)性參照時(shí)特異性高，一旦轉(zhuǎn)染成功即可使GAPDH基因沉默。有文獻(xiàn)［6］報(bào)道脂質(zhì)體試劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，本實(shí)驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000是新一代轉(zhuǎn)染試劑，實(shí)驗(yàn)劑量更小、時(shí)間更短，我們于轉(zhuǎn)染后6、24、48、72 h觀察細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)均良好，未發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞死亡，Lipofectamine3000對(duì)原代人黑素細(xì)胞的毒性可能不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響。由于siRNA作用時(shí)間短，不適用于轉(zhuǎn)染需要傳代的細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)干擾后的細(xì)胞進(jìn)行凍存和復(fù)蘇。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，siRNA的干擾效率除了與所用siRNA濃度、序列有關(guān)，與細(xì)胞傳代數(shù)也相關(guān)。細(xì)胞傳代數(shù)較高時(shí)，轉(zhuǎn)染不易成功，建議選擇2～4代原代人黑素細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。由于轉(zhuǎn)染后沒有明顯細(xì)胞死亡，細(xì)胞仍需生長(zhǎng)2～3 d才行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此在細(xì)胞融合60%～70%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染；Lipofectamine3000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染一般在6 h內(nèi)完成，細(xì)胞量過(guò)少可能造成分裂后細(xì)胞增多，轉(zhuǎn)染效率下降，而細(xì)胞過(guò)密又可造成細(xì)胞凋亡，因此選擇合適的時(shí)機(jī)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也非常重要。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功建立了siRNA轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞模型，可作為其他如黑素細(xì)胞的基因功能、分子通路等研究的參考。

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Wnt5A gene silencing in primary human melanocytes

Su Qianya,Lin Tong,Zhang Mengli,Peng Lin Laser Department,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（the current affiliation of the first author was Department of Dermatology,Zhongda Hospital Southeast University,Nanjing 210009,China）

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

Objective To optimize experimental conditions for transfecting primary human melanocytes with Wnt5A-specific siRNA,and to establish the Wnt5A gene silencing model.Methods Primary human melanocytes（PHM）were cultured in vitro.Positive control GAPDH-siRNAs at different concentrations of 0,20.0,33.3,40.0 and 60.0 nmol/L were transfected into PHM by using liposomes.Realtime fluorescence-based quantitative PCR（qPCR）was performed to select the optimal concentration of siRNA with the highest transfection efficiency.Three Wnt5A-siRNAs including Wnt5A-siRNA-793,Wnt5A-siRNA-943 and Wnt5A-siRNA-1743 were constructed and transfected into PHM separately,and qPCR was conducted to select the most specific Wnt5A-siRNA.Then,the most specific Wnt5A-siRNA was transfected into PHM,and the total mRNA and total protein were extracted after 24-,48-and 72-hour treatment.qPCR and Western blot analysis were performed to determine the optimal time with the highest transfection efficiency.Results There were significant differences in the mRNA expression of GAPDH among cells transfected with GAPDH-siRNAs at different concentrations of 0,20.0,33.3,40.0 and 60.0 nmol/L（1.009±0.161,0.086±0.010,0.140±0.016,0.285±0.095,0.012±0.007 respectively;F=69.469,P＜0.05）.Additionally,the 60-nmol/L GAPDH-siRNA group showed the lowest GAPDH mRNA expression（all P＜0.05）,as well as the best transfection efficiency.The mRNA expression of Wnt5A differed in the Wnt5A-siRNA-793 group,Wnt5A-siRNA-943 group,Wnt5A-siRNA-1743 group and the blank control group（0.331±0.010,2.229±0.029,0.078±0.006 and 1.000±0.024 respectively;F=7 006.094,P＜0.05）,and the Wnt5A-siRNA-1743 group showed the lowest Wnt5A mRNA expression（all P ＜ 0.05）,as well as the best transfection efficiency.The mRNA expression of Wnt5A differed among the Wnt5A-siRNA-1743 group after 24-,48-and 72-hour treatment and the blank control group（0.396±0.002,0.026±0.008,0.131±0.079,1.025±0.276 respectively;F=29.215,P＜0.05）,so did the protein expression of Wnt5A（112.798±0.218,77.765±0.415,30.540±0.219,130.025±0.158 respectively;F=79 122.889,P＜0.05）.Moreover,the Wnt5A mRNA expression was significantly lower in the Wnt5A-siRNA-1743 group at 48 hours compared with that at 24 and 72 hours and the blank control group（all P ＜ 0.05）,while the Wnt5A protein expression was significantly lower in the Wnt5A-siRNA-1743 group at 72 hours compared with that at 24 and 48 hours and the blank control group（all P ＜ 0.05）.Conclusion The siRNA-mediated Wnt5A gene silencing model of human melanocytes is established successfully.

Melanocytes;RNA,small interfering;Gene silencing;Wnt5A

林彤，Email：ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.003

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012507）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012507）

2016-08-05）

（本文編輯：朱思維 顏艷）