肖英平，何祥祥，戴寶玲，桂國(guó)弘，唐 標(biāo)，楊 華,*

采樣方法對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌DNA提取及高通量測(cè)序結(jié)果的影響

肖英平1，何祥祥2，戴寶玲1，桂國(guó)弘1，唐 標(biāo)1，楊 華1,*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

目的：比較涂抹法和沖洗法對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌DNA提取及高通量測(cè)序結(jié)果的影響。方法：將4 只冷鮮雞對(duì)半分開，分別采用涂抹法和沖洗法采集其表面微生物，提取基因組DNA，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，通過(guò)Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，使用QIIME等軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：兩種方法采集的樣品在細(xì)菌基因組DNA提取、菌群豐富度、多樣性及菌群結(jié)構(gòu)等方面均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。高通量測(cè)序結(jié)果表明，冷鮮雞表面細(xì)菌菌群主要分布于7 個(gè)門，10 個(gè)屬。變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，占70%以上；希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬和環(huán)絲菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占10%～20%。結(jié)論：兩種采樣方法對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌DNA提取及高通量測(cè)序沒(méi)有明顯影響，但沖洗法比涂抹法簡(jiǎn)單易行，且不易發(fā)生二次污染，因此更具有實(shí)用性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也為冷鮮雞表面細(xì)菌的研究提供了數(shù)據(jù)資料。

冷鮮雞；菌群結(jié)構(gòu)；涂抹法；沖洗法；高通量測(cè)序

近年來(lái)，我國(guó)許多城市已禁止活禽交易，實(shí)施肉雞統(tǒng)一屠宰，以冷鮮雞或“殺白雞”形式上市。所謂冷鮮雞，是指在嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)檢驗(yàn)檢疫制度和無(wú)公害管理的前提下，使屠宰后的雞肉胴體中心溫度在1～2 h內(nèi)降至0～4 ℃，并在后續(xù)加工、流通及銷售過(guò)程中一直保持此溫度的生鮮雞肉[1-2]。與現(xiàn)宰活雞相比，冷鮮雞不僅更加安全衛(wèi)生，而且由于溫度迅速降低而使肌肉僵直程度減弱，又經(jīng)過(guò)充分的解僵熟化和排酸過(guò)程，蛋白質(zhì)分解成較多的肽類、氨基酸及具有鮮味的核苷酸，使肉質(zhì)變得柔軟有彈性、口感細(xì)膩、味道鮮美，并且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)容易被人體消化吸收。因此冷鮮雞的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都高于現(xiàn)宰活雞。自20世紀(jì)90年代起，冷鮮雞就已在歐美等市場(chǎng)普及，逐漸取代了現(xiàn)宰活雞和冷凍雞[2]。

冷鮮雞在屠宰、分割及其他加工過(guò)程中污染的微生物在肉表面繁殖造成其腐敗，同時(shí)污染的一些致病菌也易導(dǎo)致食源性疾病[3-5]。冷鮮雞污染的微生物主要生長(zhǎng)在肉的表面，通常情況下肉深層無(wú)菌，因此研究肉品表面微生物群落特征對(duì)于保證冷鮮雞的質(zhì)量安全具有十分重要的意義。

近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品、畜產(chǎn)品微生物污染研究得到了迅速發(fā)展。高通量測(cè)序技術(shù)在分析微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為微生物群落研究中非常重要的工具[6-7]。國(guó)內(nèi)已有研究者利用16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肉制品和水產(chǎn)品中細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析[8-10]。

應(yīng)用高通量測(cè)序方法研究冷鮮雞微生物污染的第一步就是采集樣品表面的微生物并提取DNA。采樣方法不同可能會(huì)影響DNA提取效果并進(jìn)而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)采用涂抹和沖洗兩種方法對(duì)冷鮮雞表面微生物進(jìn)行采集，提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序分析，從而對(duì)兩種采樣方法進(jìn)行比較，以找到較適合的整只冷鮮雞的前處理方法，為冷鮮雞微生物檢測(cè)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。同時(shí)也為冷鮮雞表面微生物的菌群結(jié)構(gòu)研究提供了數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

在杭州4 家不同的超市購(gòu)買4 只不同廠家生產(chǎn)的冷鮮雞，將它們對(duì)半分開，裝于無(wú)菌采樣袋中，分別編號(hào)為A、B、C、D和a、b、c、d（A和a為來(lái)自同一只雞對(duì)半分開的樣品，其他3 只同），置于4 ℃的車載冰箱中帶回實(shí)驗(yàn)室用于實(shí)驗(yàn)。

無(wú)菌采樣袋 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?美國(guó)Zymo Research公司；瓊脂糖 美國(guó)Sunshine公司；DL5000 DNA Marker 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

5427 R臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；水平電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；SW-CF-IF超凈工作臺(tái) 蘇州安泰充氣技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品微生物采樣方法

冷鮮雞中微生物的采樣通常運(yùn)用組織切割法、皮膚切割法、涂抹法和沖洗法，前兩者為破壞性采樣方法，操作較為復(fù)雜且取樣位置局限[11-13]。冷藏條件下，細(xì)菌主要分布于表面，因此比較分析涂抹法和沖洗法兩種非破壞性采樣方式對(duì)冷鮮雞表面微生物采集效果的影響。

1.2.1.1 涂抹法

在潔凈室中，編號(hào)為A、B、C、D的樣品，采用2 塊20 cm×20 cm的無(wú)菌紗布，涂抹1/2 只雞的整個(gè)表面，然后置于與1/2 只雞質(zhì)量相等的滅菌生理鹽水中，搖勻，靜置10 min，取20 mL上清液，10 000×g離心10 min。

1.2.1.2 沖洗法

在盛放編號(hào)為a、b、c、d樣品的無(wú)菌采樣袋中加入與1/2只雞質(zhì)量相等的滅菌生理鹽水，用手握住無(wú)菌袋激烈振蕩1 min，取出雞肉樣品，靜置10 min，取20 mL上清液，10 000×g離心10 min。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取

使用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?提取細(xì)菌DNA。將上述不同采集方法離心得到的沉淀，用200 μL無(wú)菌生理鹽水重懸后轉(zhuǎn)移至ZR BashingBeadTMLysis Tube，然后按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。使用Nanodrop 2000測(cè)定提取的DNA純度和含量，并采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

以提取的冷鮮雞表面細(xì)菌DNA為模板，使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

1.2.4 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

測(cè)序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V1.7.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）對(duì)獲得的序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，剔除低質(zhì)量的DNA序列[14-16]。使用QIIME的Ucluster方法根據(jù)相似性不低于97%原則將通過(guò)質(zhì)控的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。通過(guò)繪制稀釋曲線評(píng)價(jià)所測(cè)序量是否覆蓋全部類群。采用QIIME默認(rèn)參數(shù)計(jì)算各樣品的Alpha多樣性指數(shù)（ChaoⅠ、ACE、Simpson、Shannon和覆蓋度指數(shù)）。使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTU的代表性序列進(jìn)行物種匹配，在門和屬的水平上對(duì)樣品的細(xì)菌組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌群分布結(jié)果，并繪制柱狀圖。使用GraphPad Prism 5對(duì)兩種采樣方法的數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)各個(gè)樣品OTU的種類及其豐度，計(jì)算樣品間的遺傳距離，用加權(quán)UniFrac距離表示，根據(jù)計(jì)算結(jié)果使用R軟件（Version 2.15.3）中的FactoMineR軟件包對(duì)不同采樣方法所獲得的樣品表面細(xì)菌結(jié)構(gòu)相似度進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）。使用ggplot2軟件包繪制散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞細(xì)菌基因組DNA提取

表1 樣品含量及純度Table 1 Purity and concentration of extracted DNA in each sample

涂抹法（A、B、C、D樣品）和沖洗法（a、b、c、d樣品）提取細(xì)菌基因組DNA的純度和含量見表1。1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，8 個(gè)樣本基因組條帶清晰，無(wú)降解，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求（圖1）。兩種采樣方法對(duì)細(xì)菌基因組DNA提取效果無(wú)明顯影響。

圖1 冷鮮雞樣品細(xì)菌基因組DNA提取Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA extracted from chilled chicken

2.2 樣品微生物物種豐富度及多樣性

經(jīng)過(guò)質(zhì)控、過(guò)濾等處理，本實(shí)驗(yàn)最終獲得429 492 條有效序列，各樣品間有效序列數(shù)差別不大，涂抹法樣品平均（53 700±3 663）條，沖洗法樣品平均（53 670±3 399）條，兩組無(wú)顯著性差異（P=0.994）。所獲得的有效序列根據(jù)97%相似性水平進(jìn)行OTU聚類分析，各樣品最終獲得89～157 個(gè)OTU，兩組亦無(wú)顯著差異（OUT分別為136±16和125±13，P=0.531）。各樣品的覆蓋度指數(shù)均為0.999～1，表明樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率極低，因此本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)多樣性組成（表2）。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖2），表明測(cè)序已趨于飽和，測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有物種。

圖2 各樣品稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of 8 different samples

進(jìn)一步根據(jù)97%相似性水平下OTU的信息，使用ChaoⅠ指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對(duì)樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。觀察物種數(shù)量ChaoⅠ指數(shù)（151.4±17.16和131.8±11.79，P=0.432）和ACE指數(shù)（150.2±15.14和133.8±12.23，P=0.405）顯示兩種采樣方法對(duì)于樣品細(xì)菌群落豐富度無(wú)顯著影響。Shannon指數(shù)（4.282±0.262和4.381±0.203，P=0.243）和Simpson指數(shù)（0.912±0.018和0.924±0.010，P=0.235）顯示，兩種采樣方法所獲樣品的多樣性指數(shù)也無(wú)顯著性差異（表2）。

表2 樣品測(cè)序概況Table 2 Sequencing results for each sample

2.3 冷鮮雞表面細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

圖3 各樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig. 3 Bacterial community structures of different samples

將8 個(gè)樣品中獲得的OTU分別在門和屬水平上進(jìn)行物種注釋，具體結(jié)果見表2和圖3?？梢钥闯?，本實(shí)驗(yàn)所得到的冷鮮雞表面細(xì)菌樣品的序列主要分屬于7 個(gè)門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）以及待定門TM7。其中變形菌門占70%以上，為優(yōu)勢(shì)門，其次為厚壁菌門和擬桿菌門，三者共同構(gòu)成了冷鮮雞菌群的主要結(jié)構(gòu)。在屬的水平，希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）為主要菌屬，約占冷鮮雞菌群的90%以上，豐度分布較均勻；此外，還有少量的黃桿菌屬（Flavobacterium）、香味桿菌屬（Myroides）、魏斯氏菌屬（Weissella）、漫游球菌屬（Vagococcus）以及肉桿菌屬（Carnobacterium）。

希瓦氏菌屬和假單胞菌屬是典型的腐敗菌，其低溫環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，是冷藏禽畜肉中的優(yōu)勢(shì)菌，具有很強(qiáng)的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力[18-22]。此外，不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬以及環(huán)絲菌屬中的熱死環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）也能在冷藏溫度下快速生長(zhǎng)，是冷鮮禽畜肉及水產(chǎn)品低溫貯藏過(guò)程中的常見腐敗菌[23-28]。這些腐敗菌主要是在屠宰、加工、包裝、運(yùn)輸及銷售等過(guò)程中污染雞肉，且在冷藏過(guò)程中大量繁殖，最終會(huì)導(dǎo)致冷鮮雞腐敗變質(zhì)[29-30]。本研究顯示以上菌屬分別占冷鮮雞表面菌群的約10%～20%，除環(huán)絲菌屬外，兩種采樣方法沒(méi)有顯著性差異（表3）。

表3 不同分類水平上樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其相對(duì)豐度Table 3 Bacterial community structures and their relative abundances at different classification levels in the swabbing and rising samples

2.4 樣品的聚類與主坐標(biāo)分析

根據(jù)各樣品OTU的種類及其豐度計(jì)算各樣品間的加權(quán)UniFrac距離（圖4A），并基于此對(duì)8 個(gè)樣品進(jìn)行PCoA（圖4B）。結(jié)果表明，同一只冷鮮雞的樣品顯示出明顯聚集，而不同冷鮮雞樣品之間相距較遠(yuǎn)。這表明涂抹和沖洗兩種采樣方法對(duì)于冷鮮雞表面微生物的菌群結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

圖4 各樣品菌落結(jié)構(gòu)的聚類和PCoAFig. 4 Cluster analysis and PCoA of bacterial community structure among the samples

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用涂抹法和沖洗法對(duì)冷鮮雞表面微生物進(jìn)行采集，提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序分析。結(jié)果表明：1）涂抹法和沖洗法對(duì)冷鮮雞表面微生物DNA提取效果無(wú)顯著差異；2）冷鮮雞表面細(xì)菌菌群主要分布于7 個(gè)門，變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，其中的希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，此外，厚壁菌門的環(huán)絲菌屬豐度也較高，這些優(yōu)勢(shì)菌為典型的腐敗菌[26,30]；3）兩種采樣方法對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌菌群的豐富度、多樣性以及菌群結(jié)構(gòu)均沒(méi)有明顯影響，但沖洗法比涂抹法簡(jiǎn)單易行，且不易發(fā)生二次污染，因此更具有實(shí)用性。

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Effects of Different Sampling Methods on Microbial DNA Extraction from Chilled Chicken and the High-Throughput Sequencing of Amplification Products

XIAO Yingping1, HE Xiangxiang2, DAI Baoling1, GUI Guohong1, TANG Biao1, YANG Hua1,*
(1. Institute of Quality and Standard for Agro-Products, State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;2. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective∶ To compare the swabbing and rinsing methods used for sampling chilled chicken by evaluating their effects on microbial DNA extraction and subsequent high-throughput sequencing. Methods∶ Four chilled chickens were divided into equal halves and sampled by superficial swabbing and rinsing methods for each half, respectively. Microbial genomic DNA was extracted from the collected samples and the V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene was amplified by PCR. The PCR products were then subjected to high-throughput sequencing on an Illumina HiSeq sequencing platform. The obtained sequences were processed and analyzed using QIIME and other softwares. Results∶ There was no difference in bacterial genomic DNA extraction or bacterial community richness, diversity and structures between the samples collected by the two methods (P ＞ 0.05). High-throughput sequencing showed that the bacterial community in chilled chicken samples consisted mainly of 7 phyla and 10 genera. Proteobacteria was the dominant phylum, accounting for more than 70% of the bacterial community; Shewanella, Pseudomonas, Acinetobacter, Psychrobacter, and Brochothrix were the dominant genera, each representing 10%-20% of the bacterial community. Conclusions∶ The two sampling methods exhibit no obvious difference in bacterial DNA extraction from chilled chicken or high-throughput sequencing. However,compared with swabbing, rinsing has the advantages of easy operation and non-secondary contamination, so it is more practical in microbiological analysis of chilled chicken. The experiment also provides useful data for the study of bacteria on chilled chicken.

chilled chicken; bacterial community; swabbing method; rinsing method; high-throughput sequencing

2016-12-11

浙江省公益技術(shù)運(yùn)用研究項(xiàng)目（2016C32073）；

浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地項(xiàng)目（2010DS700124-ZM1608）

肖英平（1984—），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：ypxiaozju@126.com

*通信作者：楊華（1972—），男，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：yanghua806@hotmail.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724042

TS251.55；TS207.4

A

1002-6630（2017）24-0260-05

肖英平, 何祥祥, 戴寶玲, 等. 采樣方法對(duì)冷鮮雞表面細(xì)菌DNA提取及高通量測(cè)序結(jié)果的影響[J]. 食品科學(xué), 2017,38(24): 260-264.

10.7506/spkx1002-6630-201724042. http://www.spkx.net.cn

XIAO Yingping, HE Xiangxiang, DAI Baoling, et al. Effects of different sampling methods on microbial DNA extraction from chilled chicken and the high-throughput sequencing of amplification products[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 260-264.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724042. http∶//www.spkx.net.cn