朱 偉，寧嘯駿，杜茹蕓

高效離子色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中的功能性低聚糖

朱 偉，寧嘯駿，杜茹蕓

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

建立一種同時(shí)測定蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖的高效離子色譜檢測技術(shù)，采用CarboPac PA20色譜柱分離，以氫氧化鈉-乙酸鈉為流動(dòng)相，梯度洗脫，使用脈沖安培檢測器進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下8 種功能性低聚糖得到了很好分離，回收率為80.0%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%（n=6）。該方法能快速、準(zhǔn)確、可靠地檢測嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖的含量。

配方奶粉；功能性低聚糖；高效離子色譜；脈沖安培檢測器

功能性低聚糖是指由2～10 個(gè)相同或不同的單糖，以糖苷鍵聚合而成的糖類，由于其不為人體胃酸、胃酶所降解，卻能被人體腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌群選擇性地利用，因此具有改善脂質(zhì)代謝，降低血脂和膽固醇，促進(jìn)鈣、鎂等礦物元素的吸收，提高免疫力等生理功能[1-4]。目前，功能性低聚糖如低聚果糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖，已經(jīng)成為食品工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的健康食品配料之一，不僅可應(yīng)用于飲料[5-6]、乳制品[7-8]、酒類、保健食品[9-10]，還可應(yīng)用于嬰幼兒食品中[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，添加了功能性低聚糖的嬰幼兒奶粉能促進(jìn)嬰幼兒腸道有益菌群生長，抑制有害菌，增強(qiáng)嬰幼兒的免疫力，提高腸道的防御功能，預(yù)防嬰幼兒感染性腹瀉；另外，還可以通過促進(jìn)嬰幼兒腸道蠕動(dòng)，幫助形成軟便，從而改善嬰幼兒的功能性便秘[14-19]。

GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定低聚果糖、棉子糖等功能性糖類物質(zhì)可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用于嬰幼兒配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中，該類物質(zhì)總量不超過64.5 g/kg。目前市場上出現(xiàn)了很多添加低聚糖的嬰幼兒配方奶粉，且成為了奶粉行業(yè)的一個(gè)銷售亮點(diǎn)。但有的企業(yè)僅將功能性低聚糖作為宣傳賣點(diǎn)，而在實(shí)際產(chǎn)品中添加的量極少，因此，建立一種適用于嬰幼兒配方奶粉中低聚糖含量的檢測方法顯得尤為重要。

目前測定糖類物質(zhì)的方法主要是比色法[20]、高效液相色譜法[21-25]、高效離子色譜法[7,9,26-27]等。比色法是利用顯色反應(yīng)，測定樣品中總糖的含量，因此不具備選擇性。高效液相色譜法一般與蒸發(fā)光散射檢測器或示差折光檢測器聯(lián)用，因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)在紫外區(qū)和可見光范圍內(nèi)沒有吸收，液相色譜法雖然無需衍生但靈敏度較低，難以滿足食品中低含量糖類物質(zhì)的檢測。離子色譜法通常將陰離子交換色譜柱和脈沖安培檢測器相結(jié)合，無需衍生和復(fù)雜的樣品前處理即可檢測大多數(shù)單糖和低聚糖，此方法操作簡便，且靈敏度高。為此，本實(shí)驗(yàn)基于高效離子色譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，采用CarboPac PA20色譜柱分離，通過梯度洗脫，利用脈沖安培檢測器進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、水蘇糖、棉子糖、毛蕊花糖的同時(shí)檢測，該方法能快速、準(zhǔn)確、可靠地檢測嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖含量，同時(shí)也為政府部門的監(jiān)督管理和奶粉生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制提供一種新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；蔗果三糖（純度≥99.3%）、蔗果四糖（純度≥99.3%）、蔗果五糖（純度≥94.4%） 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；蔗果六糖（純度≥98%）、蔗果七糖（純度≥98%）、水蘇糖（純度≥98.0%）、毛蕊花糖（純度≥99.7%）上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司；棉子糖（純度≥99.5%）德國Dr. Ehrenstorfer公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%氫氧化鈉溶液、無水乙酸鈉（純度≥99.0%） 美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000離子色譜儀（配有電化學(xué)檢測器） 美國Thermo Fisher公司；電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；5804離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg于10 mL的容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前根據(jù)需要用超純水稀釋配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.1.2 流動(dòng)相的配制

流動(dòng)相B：取13.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋定容至1 000 mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下?lián)u勻，配制成250 mmol/L氫氧化鈉溶液。

流動(dòng)相C：稱取20.5 g無水乙酸鈉，用約500 mL水溶解，加入2.6 mL 50%氫氧化鈉溶液，并用水定容至500 mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下?lián)u勻，配制成500 mmol/L乙酸鈉-100 mmol/L氫氧化鈉溶液。

流動(dòng)相D：稱取20.5 g無水乙酸鈉，用水溶解，并定容至500 mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下?lián)u勻，配制成500 mmol/L乙酸鈉溶液。

1.3.2 高效離子色譜檢測

采用離子色譜分析糖類物質(zhì)時(shí)，其流動(dòng)相一般為氫氧化鈉溶液，隨著流動(dòng)相中氫氧化鈉比例增大，分析時(shí)間縮短，但各峰的分離度降低，甚至?xí)霈F(xiàn)峰的重疊現(xiàn)象，同時(shí)難以排除雜質(zhì)峰的干擾。若降低流動(dòng)相中氫氧化鈉的比例，則分析時(shí)間延長，且峰形會(huì)變差，尤其是保留時(shí)間較長的組分。本實(shí)驗(yàn)采用氫氧化鈉和乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相中乙酸根的加入，不僅可以改善功能性低聚糖的分離，同時(shí)可以提高響應(yīng)的靈敏度。綜合考慮低聚糖的峰形、靈敏度、分離度和分析時(shí)間，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定梯度洗脫條件如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for gradient elution program

除了Dionex CarboPac PA20色譜柱，本實(shí)驗(yàn)還采用Dionex IonPac PA1色譜柱對低聚糖進(jìn)行了檢測分析，研究顯示，各個(gè)低聚糖的保留時(shí)間變長，且出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象。這是因?yàn)榕cPA20色譜柱相比，PA1色譜柱的基質(zhì)粒徑較大，其柱效明顯低于PA20，故選擇PA20色譜柱作為功能性低聚糖的分析柱。

高效離子色譜檢測條件：色譜柱Dionex CarboPac PA20（150 mm×3 mm，6.5 μm）；保護(hù)柱Dionex CarboPac PA20（30 mm×3 mm，6.5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：水，流動(dòng)相B：250 mmol/L氫氧化鈉溶液，流動(dòng)相C：500 mmol/L乙酸鈉-100 mmol/L氫氧化鈉溶液，流動(dòng)相D：500 mmol/L乙酸鈉溶液，梯度洗脫；流速0.45 mL/min；進(jìn)樣量25 μL。脈沖積分安培檢測器；工作電極Au電極；參比電極：Ag/AgCl電極。檢測器檢測波形見表2。

表2 糖測定的積分安培檢測波形Table 2 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3.3 樣品前處理

由于低聚糖在水中的溶解度較高，因此可以用水溶解樣品進(jìn)行提取，同時(shí)為了沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)，需在水中加入一定比例的乙腈。考察水-乙腈體積比為1∶0、3∶2、2∶3、0∶1時(shí)低聚糖的提取效果。

稱取奶粉樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），置于10 mL容量瓶中，加水4 mL，振搖使其溶解，60 ℃水浴10 min。放置冷卻至室溫后，加乙腈至刻度，搖勻。靜置10 min使其沉降（必要時(shí)延長沉降時(shí)間，或離心）。取上清液1 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，過0.22 μm濾膜及1.0 CC OnGuard RP柱，濾液供色譜分析備用。

1.3.4 精密度和回收率測定

1.3.4.1 精密度測定

取空白樣品6 份，分別添加1.3.1.1節(jié)50 μL 10.0 mg/mL蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果七糖、水蘇糖和毛蕊花糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，即添加量為100 mg/100 g，添加80 μL 10.0 mg/mL蔗果六糖和棉子糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，即添加量為160 mg/100 g，然后按1.3.3節(jié)進(jìn)行樣品前處理，并按1.3.3節(jié)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行重復(fù)測定。

1.3.4.2 回收率測定

取空白樣品18 份，分成3 組，分別加入低、中、高3 個(gè)水平的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)行樣品分析，計(jì)算方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 計(jì)算方法

1.3.5.1 樣品中各組分含量的計(jì)算

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過測得樣品中各組分的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到樣品溶液中各組分的含量，再通過式（1）計(jì)算得到樣品中各組分的含量。

式中：Xi為樣品中各組分的含量/（mg/100 g）；ci為樣品中各組分的質(zhì)量濃度/（mg/L）；V為樣品的定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；R為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.5.2 樣品中功能性低聚糖含量的計(jì)算

樣品中功能性低聚糖含量按式（2）計(jì)算：

式中：Xi為樣品中各低聚糖組分的含量/（mg/100 g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)在0.5 g樣品中只加入10 mL水時(shí)，雖然樣品能夠溶解，但由于奶粉中的蛋白質(zhì)沒有完全沉淀，提取液呈渾濁；當(dāng)在0.5 g樣品中直接加入10 mL乙腈時(shí)，奶粉中的蛋白質(zhì)與乙腈接觸后發(fā)生變質(zhì)，在奶粉的外層形成包裹，阻止樣品的分散，導(dǎo)致樣品內(nèi)部的低聚糖無法提取完全。當(dāng)水-乙腈體積比為3∶2時(shí)，由于乙腈的比例比較低，樣品中蛋白質(zhì)無法完全沉淀；當(dāng)水-乙腈體積比為2∶3時(shí)，樣品完全溶解，且提取液澄清透明，提取效果滿意。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用4 mL水溶解樣品，然后用乙腈定容至10 mL進(jìn)行提取。

2.2 離子色譜檢測結(jié)果

圖1 功能性低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig. 1 Chromatogram of a mixture of FOS standards

由圖1可知，在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的梯度洗脫條件下，采用Dionex CarboPac PA20色譜柱實(shí)現(xiàn)了8 個(gè)功能性低聚糖的基線分離。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限結(jié)果

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限Table 3 Linear regression equations, linear ranges and detection limits of functional oligosaccharides

在優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)入離子色譜檢測，以功能性低聚糖的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，所得線性方程、線性范圍及檢出限（RSN=3）結(jié)果見表3。

2.4 精密度結(jié)果

表4 功能性低聚糖含量重復(fù)測定結(jié)果（n=6）Table 4 Repeatability (RSD) of the method (n= 6)

由表4可知，8 種功能性低聚糖檢測方法的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.57%～2.11%之間。

2.5 回收率結(jié)果

表5 方法的回收率和精密度（n= 6）Table 5 Recoveries and precision (RSD) of the analytical method (n= 6)

由表5可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖的回收率分別為82.5%～103%、82.5%～98.0%、82.5%～98.4%、87.5%～93.8%、80.0%～95.4%、88.4%～93.9%、81.0%～102%和83.0%～96.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%～2.14%，表明此方法能準(zhǔn)確、可靠地測定嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖的含量。

2.6 樣品測定結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)建立的離子色譜方法，對市場上銷售的不同品牌的嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖含量進(jìn)行檢測分析。圖2為某品牌奶粉樣品的離子色譜圖。由表6可以看出，在檢測的10 批次嬰幼兒配方奶粉中，其中4 批次樣品中功能性低聚糖含量在400～500 mg/100 g，5 批次樣品中功能性低聚糖含量在500～600 mg/100 g，1 批次樣品中功能性低聚糖含量大于600 mg/100 g。

圖2 嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖的離子色譜圖Fig. 2 Chromatogram of GF2, GF3, and GF4 in infant formula milk powder

表6 嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖含量Table 6 Functional oligosaccharides contents in infant formula milk powder samples

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，目前市場上銷售的嬰幼兒配方奶粉中主要含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3 個(gè)功能性低聚糖，蔗果六糖和蔗果七糖均未檢出，這可能與低聚果糖的生產(chǎn)工藝有關(guān)。以蔗糖為原料經(jīng)過酶轉(zhuǎn)化工藝生產(chǎn)的低聚果糖，其果糖鏈較短，主要是三糖、四糖、五糖，而六糖以上的低聚糖含量較低[28-29]，進(jìn)而導(dǎo)致添加到嬰幼兒配方奶粉中的蔗果六糖和蔗果七糖含量偏低。在本實(shí)驗(yàn)所檢測的嬰幼兒配方奶粉中未檢出水蘇糖、棉子糖和毛蕊花糖，但是最新研究表明，水蘇糖、棉子糖和毛蕊花糖對雙歧桿菌的增殖效果及調(diào)節(jié)微生態(tài)的功能優(yōu)于目前應(yīng)用的所有低聚糖[30]，其作為功能性低聚糖必將被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉等各類食品中。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用高效離子色譜法測定了嬰幼兒配方奶粉中功能性低聚糖含量，通過對樣品前處理?xiàng)l件和離子色譜參數(shù)的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、水蘇糖、棉子糖和毛蕊花糖的同時(shí)檢測，該方法操作簡便快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合于嬰幼兒配方奶粉中低聚糖的檢測，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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Determination of Functional Oligosaccharides in Infant Formula Milk Powder by High Performance Ion Chromatography

ZHU Wei, NING Xiaojun, DU Ruyun
(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Shanghai 200233, China)

A method was established using high performance ion chromatography and pulsed amperometric detection for simultaneous analysis of 1-kestose (GF2), nystose (GF3), 1F-fructofuranosyl nystose (GF4), GF5, GF6, raffinose, stachyose and verbascose in infant formula milk powder. The chromatographic separation was achieved on a CarboPac PA20 column using a mobile phase composed of a mixture of sodium hydroxide and sodium acetate by gradient elution. Under the conditions optimized in this study, all the analytes were well separated, and the recoveries were 80.0%–103% with a relative standard deviation (RSD) less than 3% (n = 6). The method was rapid, accurate, reliable, and thus suitable for the determination of functional oligosaccharides in infant formula milk powder.

formula milk powder; functional oligosaccharides; high performance ion chromatography; pulsed amperometric detector DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036

O657.7

A

1002-6630（2017）24-0224-05

朱偉, 寧嘯駿, 杜茹蕓. 高效離子色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中的功能性低聚糖[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24)∶ 224-228.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036. http∶//www.spkx.net.cn

ZHU Wei, NING Xiaojun, DU Ruyun. Determination of functional oligosaccharides in infant formula milk powder by high performance ion chromatography[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 224-228. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724036. http∶//www.spkx.net.cn

2017-02-16

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014QK149）

朱偉（1982—），女，高級工程師，博士，研究方向?yàn)槭称芳盎瘖y品的檢測技術(shù)。E-mail：zhuwei@sqi.org.cn