常 強，蘇明華,*，陳清西*，曾碧玉，李惠華，王 偉

基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的橄欖果實多酚測定及其抗氧化活性分析

常 強1,2，蘇明華1,2,*，陳清西1,*，曾碧玉1,2，李惠華2，王 偉1,2

（1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006）

目的：定性分析和定量檢測橄欖（Canarium album L.）果實提取物中主要酚類物質(zhì)以及評價其抗氧化活性。方法：采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜鑒定了橄欖果實中的12 種酚類化學成分；利用多重反應(yīng)檢測模式的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立一個快速、穩(wěn)定可靠檢測橄欖果實多酚的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r＞0.98）；定量限小于1.436 ng/mL；檢出限小于4.786 ng/mL；準確度大于80.19%，精密度大于1.12%；回收率大于80.13%。適用于橄欖果實中多酚物質(zhì)的定性定量分析。對橄欖果實不同溶劑提取的多酚組分定量分析表明，3-O-沒食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，為橄欖果實提取物中主要成分。對不同溶劑提取的橄欖果實多酚及其抗氧化能力的研究表明，80%丙酮溶劑提取具有更高的多酚含量和抗氧化能力。

多酚；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；橄欖

多酚是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，已被證實具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓形成和抗動脈硬化等多種生理功能，因其自身的安全性已成為近年來食品科學的研究熱點[1]。橄欖（Canarium album (Lour.) Raeusch）屬無患子目橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物，為我國特色果樹資源，可供鮮食或加工，自古為我國常用中藥材。據(jù)報道，橄欖果實富含總酚，其含量可達280.46 mg GAE/g（以干質(zhì)量計），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為97.11%，在68 種常見中藥材中含量屬最高，抗氧化能力最強，因此被認為是一種優(yōu)良天然抗氧化劑的主要來源[2]?，F(xiàn)已報道的橄欖果實中酚類物質(zhì)有酚酸類化合物（沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、芥子酸）[3-4]、黃酮類（山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、穗花衫雙黃酮、木犀草素、槲皮素）[4-5]、鞣花單寧類化合物（異柯里拉京、六羥基聯(lián)苯二甲酸的衍生物）[3-4]。

目前，用于橄欖果實多酚類物質(zhì)定量分析的方法僅限于福林-酚比色法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[4]。其中，福林-酚比色法主要用于測定總多酚含量，無法分析多酚單體化合物含量。HPLC法可以測定多酚類組分含量，但其分辨率低、耗時長且難以達到對疊加峰相應(yīng)化合物進行準確地分離鑒定。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）法被認為是一種強大的分析手段，具有高靈敏度、檢測時間短以及更高分辨率等特點，主要基于化合物的分子質(zhì)量和離子碎片的多反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行定量檢測，可提供分子離子信息，排除在HPLC中疊加峰的干擾[6]，具有同時定量定性檢測的特點。近年來該技術(shù)已大量應(yīng)用于多酚類化合物的定量定性分析[7-12]。然而截至目前，國內(nèi)外較少有利用UPLC-MS/MS檢測橄欖果實中多酚類物質(zhì)的方法報道。

據(jù)此，本研究基于超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-Q time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）研究橄欖果實中12 種多酚化合物的質(zhì)譜信息，采用MRM模式的UPLC-MS/MS技術(shù)建立一種快速靈敏、準確分析橄欖果實中12 種多酚類成分含量的方法；并采用所建方法研究不同溶劑的橄欖果實提取物中相應(yīng)化合物的含量，測定橄欖果實提取物總多酚和總黃酮含量以及評價其抗氧化活性，為橄欖果實多酚保健功能的開發(fā)利用提供依據(jù)，對全面評價橄欖果實營養(yǎng)價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖為‘檀香’品種，于2013年11月25日到福建省福州市閩清縣采集（37°36’N，110°17’E），分別從20 株橄欖樹采摘5 kg果實用于實驗。果實要求大小均一，成熟一致，無病蟲害。

異柯里拉京（分析純） 上海詩丹德公司；3-O-沒食子?；鼘幩?、鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、鞣花酸-4-O-D-木糖、柯勒黎酸、老鸛草素以及同分異構(gòu)體為本實驗室從橄欖果實中分離（純度＞93.5%）；沒食子酸、鞣花酸、短葉蘇木酚、穗花雙黃酮、金絲桃苷、DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ）、2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）、水溶性VE（Trolox）、熒光素鈉鹽（fluoroscein disodium salt，F(xiàn)L）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride，AAPH）、福林-酚試劑 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（色譜級） 美國Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 35紫外-可見光光譜儀 美國Perkin Elmer公司；Heto PowerDry LL1500真空冷凍干燥機（冷阱倉溫度-110 ℃，面板加熱溫度為25 ℃，真空泵vacuubrand RZ2.5 Pressure 4×10-4mbar） 美國Thermo Electron公司；ACQUITY UPLC-SYNAPT G2-Si超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜、ACQUITY UPLC-Xevo TQS超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 定性分析

UPLC條件：Waters ACQUITY UPLC超高效液相系統(tǒng)，液相分析柱為T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫保持40 ℃，流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙睛；洗脫梯度為0 min，1% B；0～2 min，1%～7% B；2～13 min，7%～40% B；13～14 min，40%～99% B；14～18 min，99%～1% B；流速0.3 mL/min，進樣量1 μL。

MS條件：Waters ACQUITY UPLC配SYNAPT G2-Si HDMS質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離接口，采用負離子模式掃描；毛細管電壓2.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣流速（N2）800 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；錐孔反吹氣流速（N2）50 L/h；錐孔電壓30 V；碰撞氣電壓10～50 eV；取樣錐孔電壓35 V，微通道板電壓1 800 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；鎖定質(zhì)量校正：亮氨酸-腦啡肽（質(zhì)量濃度200 pg/μL，流速10 μL/min，[M-H]-=554.261 5 D，14 min為鎖定質(zhì)量溶液）。

1.3.2 定量分析

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%乙腈溶液；洗脫程序：0～10 min，5%～24% B；11～13 min，24%～100% B；13～16 min，100%～5% B；進樣量1 μL；流速0.3 mL/min；紫外檢測器波長范圍190～800 nm。

MS條件：ACQUITY UPLC-Xevo TQS超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；MRM模式；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓2.1 kV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣流速（N2）800 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔反吹氣流速（N2）150 L/h；碰撞氬氣流速（Ar）0.13 mL/min；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；數(shù)據(jù)處理采用MassLynx software version 4.1工作站。

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 對照品溶液制備

對照品儲備液：取用1.5 mL EP管，準確稱取各標準品1 mg，然后加入1 mL色譜甲醇溶解，其中鞣花酸，鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和鞣花酸-4-O-D-木糖難溶于甲醇，需用N,N-二甲基甲酰胺溶解。配制為1 mg/mL標準儲備液。混合對照品溶液配制：根據(jù)每個對照品信號強弱及峰面積大小，選擇不同比例配制對照品，形成混標。然后采用50%甲醇溶液稀釋為不同水平的質(zhì)量濃度溶液。

1.3.3.2 樣品溶液制備

用于方法學考察試樣：2 g樣品按照比1∶20（g/mL）的比例加入4 ℃預冷的80%甲醇溶液；10 g橄欖果肉凍干樣品按上述比例加入有機溶劑（80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮、80%乙酸乙酯和超純水）。30 ℃超聲波350 W（超純水溶劑提取樣在60 ℃水浴振蕩器中提取60 min），提取25 min，濾紙過濾，果渣再重復提取2 次。合并3 次離心上清液，真空條件下45 ℃蒸干，方法學考察樣品用甲醇-水（85∶15，V/V）定容至5 mL；-80 ℃冷藏備用。溶劑提取試樣置于真空冷凍干燥器中凍干為粉末，轉(zhuǎn)入玻璃密閉容器中-80 ℃冷藏備用。

1.3.3.3 質(zhì)量控制溶液與回收率相關(guān)溶液制備

質(zhì)量控制溶液配制：質(zhì)量控制溶液為混合基質(zhì)，其中含有3 個單糖（蔗糖、葡萄糖、果糖）質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL，分低、中、高3 個混合對照品質(zhì)量濃度加入基質(zhì)中，使混標溶液的終質(zhì)量濃度為100、400、800 ng/mL，以此作為質(zhì)量控制溶液。

回收率相關(guān)溶液配制：樣品原液稀釋500 倍，然后加入100、400 μL和800 μL的混標溶液（1 μg/mL）各兩管以及未加標樣品稀釋液。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 線性范圍實驗

將混合對照品溶液依次稀釋，得到9 個質(zhì)量濃度梯度的對照品溶液，每個質(zhì)量濃度梯度進樣3 次實驗。以峰面積y（對照品峰面積）為縱坐標，以對照品的質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.4.2 準確度和精確度實驗

準確度和精密度參照Bataglion等[7]的方法，利用質(zhì)量控制樣品來評價。日內(nèi)重復測定3 次，隨行標準曲線，根據(jù)隨行標準曲線計算質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度，連續(xù)測定3 d，共9 次，同理計算質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度。準確度根據(jù)測定的質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度和已知質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度的比值分別計算日內(nèi)和日間的平均百分比值，準確度達到80%～120%為合理區(qū)間。精密度為日內(nèi)（n=3）和日間（n=9）的變異系數(shù)，精密度小于20%為合理區(qū)間。

1.3.4.3 回收率實驗

回收率按下式計算：

1.3.4.4 檢出限和定量限測定

將混合對照品溶液不斷稀釋，每個質(zhì)量濃度梯度進樣3 次。信噪比為3和10時所對應(yīng)的對照品質(zhì)量濃度即為檢出限和定量限。

1.3.5 總多酚和總黃酮含量以及抗氧化活性分析

總多酚含量采用福林-酚比色法[4]并作適當修改，沒食子酸作為標準曲線，總多酚提取量以每克干質(zhì)量等同于沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）的毫克數(shù)表示（mg GAE/g）；總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法測定[13]，蘆丁作為標準曲線，總黃酮含量以每克干質(zhì)量等同于蘆?。╮utin equivalent，RE）的毫克數(shù)表示（mg RE/g）；多酚化合物含量以干質(zhì)量計（mg/g）。

總還原力采用鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定[14]。準確吸取橄欖果實多酚樣提取液50 μL，加入3 mL TPTZ工作液，37 ℃條件下水浴30 min，測定波長593 nm處吸光度。Trolox作為標準曲線，樣品中FRAP值以每克干質(zhì)量相當Trolox當量的微摩爾數(shù)表示（μmol TE/g）。

DPPH法測定樣品提取液的抗氧化能力[15]。取樣品溶液50 μL，置于5 mL離心管中，加入3.0 mL 6.0×10-5mol/L的DPPH試劑（2.4 mg DPPH溶解與100 mL乙醇溶劑中得到，DPPH試劑現(xiàn)配現(xiàn)用），搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，同時以無水乙醇為空白，于波長517 nm處測定吸光度。計算自由基清除率達到50%的樣品質(zhì)量濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

清除ABTS＋·能力測定參照Choi等[16]的方法，并略作修改。3.0 mL ABTS工作液，加入50 μL Trolox或不同質(zhì)量濃度樣品稀釋液，準確振蕩30 s，測定反應(yīng)6 min后于波長734 nm處的吸光度，計算IC50值。

氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）參考Huang Dejian等[17]方法并加以改進。向96 孔板中加入橄欖果實提取液25 μL，10 min后向各孔加入150 μL FL工作液和25 μL AAPH，振蕩5 s后進行讀數(shù)。設(shè)置激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm，每2 min測定一次熒光強度，測定時間為達到初始熒光強度的5%為止。計算熒光衰退曲線下面積。然后將其與Trolox凈熒光衰退曲線條件下面積的比值與二者濃度（C）的比值做比，獲得ORAC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果實中12 種多酚化合物定性分析

圖1 UPLC-QTOF-MS圖譜Fig. 1 Representative UPLC-QTOF-MS chromatograms of fruit extracts of Chinese olives and a standard mixture of phenols

UPLC-QTOF-MS技術(shù)由于具有分辨率高、質(zhì)量范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于酚類化合物的精確分子質(zhì)量檢測[18-21]。本研究利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)檢測了橄欖果實12 種多酚類化合物；并根據(jù)樣品化合物的出峰時間、最大吸收波長以及在負離子模式下的質(zhì)譜信息，結(jié)合對照品和相關(guān)文獻[3-4]，對化合物進行鑒定，如圖1和表1所示。

表1 橄欖果實提取物的UPLC-QTOF-MS譜圖鑒定Table 1 UPLC-QTOF-MS characterization of phenolic compounds in Chinese olive fruit

如圖1所示，橄欖果實提取物中化合物主要集中于2～10 min內(nèi)，該段時間的流動相為5%～24%乙腈溶液，說明橄欖果實多酚屬中極性化合物。從表1可以看出，12 個已選化合物的最大吸收波長均在200～400 nm之間，屬于多酚類物質(zhì)的特征吸收波長。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同將12 個化合物分為4類：沒食子酸衍生物（沒食子酸和3-O-沒食子?；鼘幩幔Ⅶ坊ㄋ嵫苌铮坊ㄋ?、鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和鞣花酸-4-O-D-木糖）、鞣花單寧（異柯里拉京、柯勒黎酸、老鸛草素及其同分異構(gòu)體）、黃酮類（短葉蘇木酚、穗花雙黃酮、金絲桃苷）。

2.2 橄欖果實中12 種多酚化合物UPLC-MS/MS定量分析

相比HPLC系統(tǒng)，UPLC具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測時間[22]。本研究選擇12 種多酚化合物可在15 min內(nèi)完成檢測。UPLC的流動相選用文獻中最為常見的系統(tǒng)[23]：0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液。經(jīng)正負離子掃描對比，發(fā)現(xiàn)負離子模式下響應(yīng)高，背景干擾少，且橄欖果實中富含多元酚類物質(zhì)，屬于酸性化合物，適宜于負離子模式檢測，因此采用負離子模式掃描。為了得到母離子和特征子離子以及優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，采用針泵將標準品混標甲醇溶液進樣，以全掃描確定母離子，然后找出響應(yīng)信號最強的1 種或2 種碎片離子作為對應(yīng)的子離子，最終以母離子和子離子組成檢測離子對，以響應(yīng)信號最強的離子為定量離子，采用MRM方式對樣品進行定性定量分析。如圖2、表2所示。優(yōu)化后，MRM的質(zhì)譜檢測技術(shù)可對色譜峰重疊的化合物分別給出準確的定性定量信息，從而可有效避免因部分化合物在色譜上難以完全分離而導致不準確的定量結(jié)果，達到準確可靠的定量目的。

圖2 多酚標準溶液的碎片離子色譜圖Fig. 2 UPLC-MS/MS identification of phenolic standards and phenolic compounds present in Chinese olive fruit

表2 UPLC-MS/MS分析定量酚類化合物的MRM參數(shù)Table 2 List of MRM parameters for qualified and quantified phenolic compounds in the UPLC-MS/MS analysis

2.3 UPLC-MS/MS定量分析方法學考察結(jié)果

為了評價在MRM模式下UPLC-MS/MS檢測方法的有效穩(wěn)定性，本研究考察了相關(guān)質(zhì)量控制參數(shù)，保證備選的多酚組分很好地被定性定量。

表3 UPLC-MS/MS定量分析的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率Table 3 Regression equations, linearity ranges, correlation coefficients,limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and recovery for quantitative analysis of phenolic compounds by UPLC-MS/MS

表4 質(zhì)量控制樣本評價方法的日內(nèi)和日間準確度和精密度Table 4 Intra-and inter-day precision and accuracy for quality control(QC) samples at three different concentration levels

不同質(zhì)量濃度混合標準品溶液，于優(yōu)化后條件分別進樣測定，以各組分特征離子峰面積為縱坐標，以9 種質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，如表3所示。12 種多酚在0.5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（0.985～0.999）；定量限和檢出限分別為0.049～1.436 ng/mL和0.163～4.786 ng/mL。為了進一步評價該方法的準確性和精確性，利用質(zhì)量控制溶液作為評價溶液體系，如表4所示。該方法的日內(nèi)和日間準確度在80.19%～120.81%之間，日內(nèi)和日間的精密度在1.12%～12.64%之間，均在所規(guī)定范圍內(nèi)（準確度為（100±20）%，變異系數(shù)小于10%）。表明該方法具有良好的準確度和精密度。平均回收率在80.13%～112.01%之間，表明該方法的回收率達到要求。可見，UPLC-MS/MS的MRM模式可在保證分離度的情況下大大縮短了分析時間，同時在很大程度上節(jié)省了溶劑消耗，降低了分析成本，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強、快捷準確的特點。

2.4 橄欖果實多酚組分含量以及抗氧化活性分析

表5 橄欖果實不同溶劑提取的多酚化合物含量Table 5 Contents of phenolic compounds in different extract solvents of Chinese olive fruitmg/g

利用建立的UPLC-MS/MS的MRM模式對橄欖果實不同溶劑提取的多酚組分含量進行測定。如表5所示，80%丙酮溶液對12 種化合物具有更高的提取率，其次是80%甲醇溶液和80%乙醇溶液，80%乙酸乙酯溶液和水為最低。沒食子酸衍生物、鞣花酸衍生物和鞣花單寧類物質(zhì)為主要組成部分，黃酮類含量最低。單個組分中，3-O-沒食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，分別為22.09～47.42 mg/g和1.77～62.84 mg/g。He Zhiyong等[4]研究表明橄欖果實多酚中沒食子酸含量最高，而林玉芳等[24]則認為鞣花酸含量最高。本實驗結(jié)果與前人研究存在差異的原因可能是采用不同檢測方法所造成。本研究采用UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，主要是根據(jù)化合物的碎片離子的響應(yīng)值定量并且利用相應(yīng)離子對定性，而前人研究均采用HPLC分析技術(shù)，該方法是根據(jù)化合物吸收紫外光定量，由于疊加峰的存在很難達到定性的目的。因此，本研究對橄欖果實多酚組分的定性定量更具針對性。本研究還發(fā)現(xiàn)3-O-沒食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體在80%丙酮提取液中含量最高。據(jù)報道，3-O-沒食子酸奎寧酸具有抗HIV活性[25]，老鸛草素具有鎮(zhèn)痛和抗感染病活性[26]。表明80%丙酮溶劑適用于提取橄欖果實中3-O-沒食子酸奎寧酸和老鸛草素以用于藥物先導化合物。

不同溶劑提取對橄欖果實提取物的總多酚和總黃酮含量同樣有顯著影響。從表6可以看出，總多酚提取量最高的為80%丙酮溶液，為171.95 mg GAE/g。其次為80%甲醇溶液和80%乙醇溶液，80%乙酸乙酯溶液和水最低。這表明溶劑的極性可能引起多酚提取量不同的原因。Kuo等[27]報道橄欖果實采用不同溶劑提取對多酚含量的提取能力依次為50%乙醇溶液＞水＞甲醇＞丙酮＞乙酸乙酯，本研究采用80%丙酮溶液提取多酚含量高于Kuo等[27]采用純丙酮溶劑提取的多酚提取量。這表明雙溶劑系統(tǒng)比單一溶劑系統(tǒng)多酚提取效率更高[28]。

表6 橄欖果實不同溶劑提取的總多酚、總黃酮含量以及抗氧化能力Table 6 Contents of total phenolics, total flavonoids and antioxidant activities indifferent solvent extracts of Chinese olive fruit

采用4 種抗氧化活性評價方法（DPPH、ABTS、FRAP和ORAC）對不同溶劑提取進行研究。由表6可知，80%丙酮溶液提取的DPPH和ABTS法IC50值最低，分別為0.78 mg/mL和0.27 mg/mL。較低的IC50值具有更高的自由基清除能力[29]。表明80%丙酮溶液的橄欖果實提取物清除自由基的能力最強，其余順序依次為80%甲醇溶液＞80%乙醇溶液＞80%乙酸乙酯溶液＞水。FRAP和ORAC表現(xiàn)為同樣的趨勢，說明80%丙酮溶液橄欖果實提取物的總還原能力和氧自由基清除能力最強。這表明提取溶劑對橄欖抗氧化能力同樣具有顯著影響。前人研究表明，提取物間抗氧化能力的顯著差異，本質(zhì)上是由于提取溶劑極性的差異，使得提取出的抗氧化物質(zhì)含量存在差異[30]。

表7 抗氧化能力與總多酚和黃酮的相關(guān)性分析Table 7 Correlation coefficients between antioxidant capacity and total phenols and total flavonids contents

如表7所示，總多酚和總黃酮含量與抗氧化能力顯著或極顯著正相關(guān)，這表明橄欖果實抗氧化活性主要歸因于其高含量的總多酚。單寧類物質(zhì)相比黃酮具有更強的抗氧化能力[31]，且沒食子?；鶖?shù)量、分子質(zhì)量大小以及鄰位酚羥基結(jié)構(gòu)均可增強單寧的抗氧化[32]。本研究結(jié)果表明，橄欖果實提取物中主要含有沒食子酸衍生物以及鞣花單寧類物質(zhì)，如異柯里拉京、柯勒黎酸、老鸛草素及其同分異構(gòu)體。此類具多羥基和沒食子酰基的組分可能是強抗氧化活性的主要貢獻者。

3 結(jié) 論

本研究利用UPLC-QTOF-MS分析了橄欖中已選擇的12 種多酚化合物的質(zhì)譜信息，并根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為沒食子酸及其衍生物、鞣花酸及其衍生物、鞣花單寧、黃酮共4 組。利用MRM模式的UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一個快速、穩(wěn)定靈敏的可定性定量橄欖果實多酚的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r＞0.98）；檢出限小于4.786 ng/mL；定量限小于1.436 ng/mL；準確度大于80.19%，精密度大于1.12%。回收率大于80.13%；表明該方法可以對橄欖果實多酚組分進行真實的定性定量檢測。對橄欖果實不同溶劑提取的多酚組分定量分析表明，沒食子酸衍生物、鞣花酸衍生物和鞣花單寧類物質(zhì)為主要組成部分，黃酮類含量最低。單個組分中，3-O-沒食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，為橄欖果實提取物中主要多酚類化合物。對不同溶劑提取的橄欖果實多酚及其抗氧化能力的研究表明，80%丙酮溶劑提取具有更高的多酚含量和抗氧化能力。

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Determination of Polyphenols and Antioxidant Activity in Chinese Olive Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHANG Qiang1,2, SU Minghua1,2,*, CHEN Qingxi1,*, ZENG Biyu1,2, LI Huihua2, WANG Wei1,2
(1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen 361006, China)

The aims of the study were to identify and quantify the phenolic compounds present in extracts of Chinese olive fruit (Canarium album L.) and to investigate their respective antioxidant activities. A total of 12 phenolic compounds were identified in Chinese olive fruit by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) coupled to time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS). A quantitative method was established by UPLC coupled to triple quadrupole mass spectrometry(TQ-MS/MS) under the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Phenolic compounds were separated within 15 min.The linearity (r ＞ 0.98), limit of detection (LOQ) (＜ 1.436 ng/mL), limit of quantification (LOQ) (＜ 4.786 ng/mL), interand intra-day accuracy ( ＞ 80.19%), precision ( ＞ 1.12%) and recovery ( ＞ 80.13%) of the method were all satisfactory and thus it could provide an efficient protocol to analyze phenolic compounds in fruit pulp extracts of Chinese olive. Quantitative analysis of different solvent extracts suggested that 3-O-galloylquinic acid and Geraniin isomers was the most abundant polyphenols in Chinese olive. Furthermore 80% acetone extract contained more polyphenols and possessed stronger antioxidant capacity.

phenolic compounds; ultra-performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS); Chinese olive

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724024

S667.5

A

1002-6630（2017）24-0150-09

常強, 蘇明華, 陳清西, 等. 基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的橄欖果實多酚測定及其抗氧化活性分析[J]. 食品科學,2017, 38(24): 150-158.

10.7506/spkx1002-6630-201724024. http://www.spkx.net.cn

2017-04-12

廈門市科技計劃資助項目（3502Z20142001）；福建省科技重大專項（2013N002-4）；

廈門市重大科技創(chuàng)新平臺項目（3502Z20131004）；福建省亞熱帶植物研究所基金項目（20150318-1）

常強（1983—），男，助理研究員，博士研究生，研究方向為植物天然產(chǎn)物開發(fā)。E-mail：chyile_1@163.com

*通信作者：蘇明華（1952—），男，研究員，本科，研究方向為果樹生理生化。E-mail：mhsu068@163.com

陳清西（1964—），男，教授，博士，研究方向為園藝植物栽培生理。E-mail：cqx0246@fafu.edu.cn

CHANG Qiang, SU Minghua, CHEN Qingxi, et al. Determination of polyphenols and antioxidant activity in Chinese olive fruits by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 150-158. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724024. http∶//www.spkx.net.cn