王俐娟，梁杏秋，王曉琴,2,*

茶葉籽油酚類化合物分離純化組分分析及HepG2細胞增殖活性抑制

王俐娟1，梁杏秋1，王曉琴1,2,*

（1.華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2.華僑大學 油脂及天然產(chǎn)物研究所，福建 廈門 361021）

以茶葉籽油為材料，采用60%甲醇溶液提取酚類化合物，經(jīng)硅膠柱層析后，選取Sephadex LH-20柱對酚類化合物進行分離純化，并采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測技術分析純化后酚類化合物的組分。以HepG2細胞為供試細胞，結合主成分分析，初步確定茶葉籽油中具有抑制癌細胞活性的酚類化合物。結果表明，Sephadex LH-20柱分離的3 個組分中，F(xiàn)r1組分所含5 種化合物主要為兒茶素類或黃酮類，其中兒茶素類占62.60%；Fr2組分主要含酚酸類及黃酮類；Fr3組分中黃酮類占78.70%。Fr1、Fr2、Fr3組分抑制HepG2細胞增殖的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%。對Fr1、Fr2、Fr3組分中酚類化合物及各組分IC50值進行主成分分析，表明茶葉籽油中兒茶素、蘆丁為主要HepG2細胞增殖活性抑制成分。

茶葉籽油；酚類化合物；分離純化；HepG2；抗增殖

茶葉籽油來源于山茶屬植物茶（Camellia sinensis O.Ktze.）的種子，其油脂包括多種人體必需脂肪酸、生育酚、植物甾醇和酚類化合物等活性組分[1-2]，是我國衛(wèi)生部認定的新資源食品。目前對茶葉籽油酚類化合物的研究資料主要集中在總含量及主要組分的分離，對茶葉籽油中酚類化合物的組成及生物活性研究報道較少。Fazel等[3]采用高效液相色譜技術對伊朗南方地區(qū)茶葉籽油酚類化合物進行分析鑒定，共鑒定出8 種酚類化合物。本課題組測定了28 種不同品種茶葉籽毛油中茶多酚含量，得出其含量達16.7～529.3 mg沒食子酸/kg，同時對茶葉籽油微量活性物質與抗氧化作用進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)茶葉籽油酚類化合物具有強抗氧化活性[1,4]。

研究報道表明氧化是產(chǎn)生慢性疾病如癌癥、老化的主要原因之一，具有強抗氧化活性的多酚類化合物，通常具有抑制腫瘤作用[5-6]。Raquel等[7]通過橄欖油中酚類化合物對結腸腺癌Caco-2/TC7細胞增殖抑制作用研究，表明橄欖油中酚類化合物可使Caco-2/TC7細胞阻滯在G0/G1和S期，誘導Caco-2/TC7細胞凋亡，并提高對致癌物的解毒作用。Maurya等[8]研究表明槲皮素可誘導人肝癌細胞HepG2中p53因子從而抑制磷脂酰肌醇-3激酶和蛋白激酶C發(fā)揮人肝癌HepG2細胞的抑制增殖作用。同時有報道指出酚類化合物可參與表觀遺傳機制如DNA甲基化、蛋白質組乙?；?、miRNA的調控，具有廣泛臨床應用價值[9-10]。茶葉提取物含多種天然酚類化合物，其通過干擾相關酶活性及信號轉導通路的抑制癌細胞增殖機制已有報道[11-12]，而茶葉籽油因與茶葉同源，富含天然多酚，它潛在的生理活性作用仍有待探索。本實驗對茶葉籽油酚類化合物進行分離純化，采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測技術分析組成及含量，結合HepG2供試細胞抗增殖實驗和主成分分析，對其抗腫瘤細胞增殖活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茶葉籽油自制：采摘成熟茶葉籽自然晾干后冷榨。

沒食子酸、羥基酪醇、4-羥基苯乙酸、咖啡酸、苯甲酸、肉桂酸、蘆丁標準品 美國阿拉丁生物科技有限公司；表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、山柰酚標準品 美國Sigma公司。

粗孔（ZCX-Ⅱ）硅膠 青島裕民源硅膠試劑廠；LH-20葡聚糖凝膠 美國GE公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國Hyclone公司；3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基溴化四唑（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）試劑 上海碧云天生物技術有限公司；人肝癌細胞（HepG2） 中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

TDL-60B臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠；Multlskan酶標儀 美國Thermo公司；HF90型CO2培養(yǎng)箱上海力申科學儀器有限公司；LC-20高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取沒食子酸、羥基酪醇等14 種標準品各10 mg，分別用10 mL色譜純甲醇定容，得到各標準溶液。分別移取1.0 mL上述標準溶液，用甲醇定容至50 mL，得多酚混合標準貯備液，繪制標準曲線時將混合標準品用甲醇稀釋成不同質量濃度梯度。用0.45 μm微孔濾膜過濾，用于色譜定性和定量分析。

1.2.2 樣品前處理

參照橄欖油和山茶油[13-16]的前處理方法，得到茶葉籽油多酚化合物粗提液，再依次用硅膠柱和Sephadex LH-20柱分離純化其中的多酚化合物。準確稱取50 g茶葉籽油，加入50 mL正己烷搖勻，加入50 mL提取液（50%乙醇溶液）于旋渦混合器中充分振蕩3 min后，3 500 r/min離心10 min，棄去正己烷萃取層，以除去脂溶性物質。重復提取3 次，合并甲醇粗提液于35 ℃條件下旋蒸濃縮至干后，用石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）溶液溶解定容至10 mL，得茶葉籽油多酚化合物粗提液。

多酚化合物粗提液經(jīng)硅膠柱層析[17-18]，用石油醚-乙酸乙酯溶液（9∶1、3∶1、3∶2、1∶1、0∶1，V/V）進行梯度洗脫，以50 mL/份收集洗脫液，以1%三氯化鐵與2%鐵氰化鉀的等體積混合物作為顯色劑，環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸（10∶2∶0.5，V/V）溶液為展開系統(tǒng)，在硅膠板上分別點樣分析，相同的組分合并，將收集到的組分真空旋蒸濃縮。濃縮液過Sephadex LH-20柱，用氯仿-甲醇（1∶1，V/V）溶液等梯度洗脫，10 mL/份收集洗脫液，得Fr1、Fr2、Fr3組分，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，置于-20 ℃條件下待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：WondaSil反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-乙腈-乙酸（5∶5∶0.1，V/V）溶液（A），0.2%乙酸溶液（B），采用表1中多級線性梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長280 nm，進樣量10 μL，每次進樣前平衡5 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.2.4 色譜峰定性、定量

線性關系考察：將配制好的梯度混合標準品溶液，按1.2.3節(jié)色譜條件進樣分析。每個樣重復進樣3 次，以對照品的質量濃度（mg/L）對峰面積Y進行線性回歸分析。

在相同色譜條件下，首先將14 種單體酚分別進樣，確定各單體酚的保留時間和出峰順序，對混合標準品溶液進樣，得混合標準品色譜圖，再將茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3分別進行測試，得各組分對應色譜圖。首先將標準品和各組分中峰的保留時間進行比較，初步定性鑒定出未知物；然后向多酚純化組分中分別單一加入該初步鑒定的單體酚進行測試，將得到的色譜圖與各組分對應色譜圖進行比較，根據(jù)峰高是否增加來驗證各個組分，完成茶葉籽油提取物中酚類化合物的定性。最后根據(jù)標準品的線性回歸方程計算茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3中鑒定出來的酚類化合物含量。

1.2.5 茶葉籽油酚類化合物不同組分對HepG2細胞生長的影響

采用MTT法檢測茶葉籽油酚類化合物不同組分對HepG2細胞生長的影響。將HepG2細胞接種于DEME培養(yǎng)基中，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化進行傳代。取對數(shù)生長期細胞，調整細胞濃度為5×104個/mL，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。將流分Fr1、Fr2、Fr3減壓蒸干，分別用25 μL甲醇溶解后，加入DEME培養(yǎng)基使終體積為5 mL作為母液，分別配制含不同體積分數(shù)的茶葉籽油酚類化合物組分（2.5%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養(yǎng)基，甲醇溶液的體積分數(shù)不超過0.5%。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL上述不同體積分數(shù)梯度的Fr1、Fr2、Fr3多酚化合物組分，甲醇溶劑對照組加入分別含0.1%、0.2%、0.5%甲醇的DEME培養(yǎng)基，空白對照組加入DEME培養(yǎng)基，均設6 個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加10 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入與初始體積等量的Formazan溶解液，利用酶標儀在570 nm和630 nm雙波長檢測各孔吸光度，用Bliss法按下式計算細胞抑制率（IC50值）：

2 結果與分析

2.1 茶葉籽油多酚化合物定性定量分析

圖1 14 種酚類化合物混合標準品的液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of mixture of 14 phenolic standards

根據(jù)前人的研究結果[19-21]，選定本實驗中14 種單體酚作為標準對照品。采用1.2.3節(jié)色譜條件，能有效分離14 種標準品，如圖1所示。分別以各個混合標準品溶液的質量濃度x（mg/L）為橫坐標，相應峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸分析，根據(jù)信噪比為3時，測得各組分檢出限，如表2所示。同一混合標準品溶液平行測定6 次，各峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.2%～10.8%之間，保留時間的RSD在0.1%～2.1%之間，表明該方法具有較好的精密度（重復性）。

表2 14 種酚類物質的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits for 14 phenolics

2.2 茶葉籽油多酚化合物純化組分分析

Fr1、Fr2、Fr3組分分別采用1.2.3節(jié)色譜條件進行分析，如圖2所示。比較各組分與混合標準品峰的保留時間及加標實驗，確定各組分組成，同時根據(jù)表2中線性回歸方程計算各組分中具體物質相對含量，如表3所示。Fr1組分中含兒茶素、山柰酚、表兒茶素沒食子酸酯、肉桂酸、槲皮素，主要分屬兒茶素類及黃酮類，其中兒茶素類化合物占62.60%；Fr2組分含山柰酚、肉桂酸、兒茶素、沒食子酸、咖啡酸及表兒茶素沒食子酸酯，山柰酚占50.70%；Fr3組分含9 種酚類物質，其中黃酮類化合物（蘆丁、槲皮素、山柰酚）占78.70%。由于油脂中酚類化合物存形式復雜，所以對于茶葉籽油中單個酚類化合物的分離純化，有待在后續(xù)實驗中開發(fā)。

圖2 茶葉籽油多酚純化組分Fr1（A）、Fr2（B）、Fr3（C）的液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatograms of Fr1 (A), Fr2 (B), and Fr3 (C) from tea seed oil

表3 茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3中各酚類化合物相對含量Table 3 Phenolic constituents of Fr1, Fr2 and Fr3

2.3 茶葉籽油酚類化合物對HepG2細胞體外增殖活性抑制效果

體積分數(shù)0.1%、0.2%、0.5%甲醇溶劑對照組的細胞相對成活率分別是99.91%、99.76%、99.48%，與各組分實驗組的細胞成活率相比，可視為無影響。有關研究也表明，在細胞體外實驗中，甲醇溶液的體積分數(shù)控制在0.5%以下，可避免其毒性對實驗造成假陽性結果[22]。研究表明茶中兒茶素、黃酮類化合物在高質量濃度條件下存在細胞毒性，可能與其在高濃度條件下引起的促氧化作用相關[23-24]。閆敬娜等[25]通過亞甲基藍染色法檢測細胞存活率實驗表明茶葉多酚提取物對受試細胞的無毒性劑量范圍為0～500 μg/mL，香菇柄多酚主要為兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸和槲皮素，與茶葉籽油分離純化組分中多酚組成類似，其在質量濃度不小于1.71 mg/mL時對HepG2顯示細胞毒性[26]，本實驗中茶葉籽油酚類化合物組分質量濃度均在上述無毒性范圍內。

圖3 茶葉籽油酚類化合物純化組分對HepG2細胞增殖的影響Fig. 3 Effect of purified phenolic constituents from tea seed oil on proliferation of HepG2 cells

采用1.2.5節(jié)方法，考察茶葉籽油酚類化合物Fr1、Fr2、Fr3組分分別對HepG2癌細胞增殖活性抑制作用，如圖3所示。Fr1、Fr2、Fr3組分對應的抑制癌細胞增殖的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%，各組分對HepG2癌細胞的抑制活性大小排列順序為Fr1＞Fr3＞Fr2，F(xiàn)r1組分能明顯抑制HepG2癌細胞活性。

圖4 茶葉籽油酚類化合物主成分分析圖Fig. 4 Principal component analysis for identification of antiproliferative phenols in tea seed oil

結合2.2節(jié)中已知的Fr1、Fr2、Fr3組分多酚化合物具體組成，與其對應的IC50值進行主成分分析，比較各酚類化合物對人肝癌HepG2細胞系的體外抑制活性，如圖4所示。Fr1～Fr3組分中酚類化合物被分為兩大主成分，所提取到特征值能達到90%以上的貢獻率，其中第1主成分的貢獻率為65.87%，大于第2主成分貢獻率（34.13%），對第1主成分貢獻最大的化合物是兒茶素、蘆丁及槲皮素，對第2主成分貢獻較大的化合物為沒食子酸、肉桂酸。表明茶葉籽油中的兒茶素類與黃酮類化合物對人肝癌HepG2細胞增殖起主要抑制作用，尤以兒茶素、蘆丁、槲皮素為主。茶葉多酚如兒茶素及黃酮類化合物對腫瘤細胞的增殖活性抑制作用已被廣泛報道，研究表明，未分離純化的茶葉多酚提取物對多種腫瘤細胞如HepG2、A549、MGC803細胞均具有誘導細胞凋亡及抑制增殖作用[27-28]，此外兒茶素、槲皮素單獨作用于腫瘤細胞時，也表現(xiàn)出顯著的癌細胞增殖抑制作用[29-30]。本實驗初步證實，在茶葉籽油中分離純化的茶多酚及黃酮類化合物也存在抑制癌細胞增殖作用。

3 結 論

茶葉籽油酚類化合物經(jīng)硅膠柱、Sephadex LH-20柱分離純化，得到組分Fr1、Fr2、Fr3。采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測技術分析表明：Fr1主要含兒茶素類化合物，占比達62.60%；Fr2除主要的黃酮類，還含有部分酚酸類化合物，如肉桂酸占25.6%；Fr3中主要含黃酮類，其中蘆丁相對含量高達64.10%。Fr1～Fr3組分對HepG2細胞的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%，表明Fr1抑制HepG2細胞活性最顯著，其次為組分Fr3，結合主成分分析，得出茶葉籽油中的黃酮類及兒茶素類化合物具有較強的HepG2細胞增殖活性抑制作用，尤以兒茶素、蘆丁為主要活性物質。本研究初步證實茶葉籽油酚類化合物具有抗腫瘤作用，可為茶葉籽油酚類化合物及活性研究提供基礎資料，同時為茶葉籽資源深度開發(fā)提供參考。

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Isolation and Purification of Phenolic Compounds from Tea Seed Oil and Their Antiproliferative Activity on HepG2 Cells

WANG Lijuan1, LIANG Xingqiu1, WANG Xiaoqin1,2,*
(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Institute of Oil and Natural Product, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Phenolic compounds from tea seed oil were extracted with 60% methanol and purified by sequential chromatography on silica gel and Sephadex LH-20 columns. The composition of purified phenolics was determined by RPHPLC-DAD. Phenolic compounds with antiproliferative effect on HepG2 cells were identified by principal component analysis. The results showed that as one of the three fractions separated by Sephadex LH-20, Fr1 contained 5 phenolic compounds including catechins (accounting for 62.60% of the total amount) and flavonoids. Fr2 mainly included phenolic acids and flavonoids; flavonoids represented 78.70% of Fr3. IC50values of Fr1, Fr2, and Fr3 for the proliferation inhibition of HepG2 cells were 1.76%, 16.24%, and 12.35%, respectively. Principal component analysis showed that rutin and catechin were the major constituents in tea seed oil that had a significantly strong ability to inhibit cell viability.

tea seed oil; phenolic componds; isolation and purification; HepG2; antitumor activity

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724016

TS225.1

A

1002-6630（2017）24-00101-06

王俐娟, 梁杏秋, 王曉琴. 茶葉籽油酚類化合物分離純化組分分析及HepG2細胞增殖活性抑制[J]. 食品科學, 2017,38(24): 101-106.

10.7506/spkx1002-6630-201724016. http://www.spkx.net.cn

WANG Lijuan, LIANG Xingqiu, WANG Xiaoqin. Isolation and purification of phenolic compounds from tea seed oil and their antiproliferative activity on HepG2 cells[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 101-106. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724016. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-07

國家自然科學基金青年科學基金項目（31601403）；福建省科技計劃高校產(chǎn)學合作項目（2017N51010055）；廈門市科技計劃項目（3502220161230）；華僑大學中青年教師科研提升資助計劃項目（ZQN-PY417）；華僑大學研究生科研創(chuàng)新能力培育計劃資助項目（1400215009）

王俐娟（1993—），女，碩士研究生，研究方向為油脂及天然產(chǎn)物。E-mail：Wang-Lijuan@foxmail.com

*通信作者：王曉琴（1977—），女，副教授，博士，研究方向為油脂及天然產(chǎn)物。E-mail：wangxiaoqin77@sohu.com