王慶西

(山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院，山東 濟南 250013)

老年宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16-E6、p53 mRNA表達及其與放療敏感性的相關(guān)性

王慶西

(山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院，山東 濟南 250013)

目的分析老年宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒(HPV)16-E6、p53 mRNA表達及其與放療敏感性的關(guān)系。方法40例宮頸癌患者均按計劃進行根治性放射治療前后采用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PT-PCR)檢測宮頸癌組織中HPV16-E6、p53 mRNA的表達水平，并根據(jù)治療結(jié)果分為有效組29例和無效組11例，分析HPV16-E6、p53與放療敏感性的關(guān)系。結(jié)果治療總有效率為72.50%；放療前后無效組2例HPV16-E6、p53 mRNA和蛋白差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，放療前后有效組4例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表達水平明顯改善，HPV16-E6蛋白表達水平顯著低于無效組，p53蛋白表達水平顯著高于無效組(Plt;0.05)。結(jié)論HPV16-E6感染、p53基因異常參與了老年宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程，檢測HPV16-E6、p53 mRNA的表達可判斷宮頸癌組織放療敏感性。

宮頸癌；放療敏感性；人乳頭狀瘤病毒(HPV)16-E6；p53 mRNA

正常宮頸發(fā)展為宮頸癌過程緩慢，其中人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染起一定促進作用〔1〕。目前臨床治療宮頸癌方法包括手術(shù)和放射治療，80%宮頸癌患者需要放療作為單獨治療或綜合治療的手段。但在臨床中發(fā)現(xiàn)，部分患者因腫瘤對放射線抵抗導致治療失敗，可能與不同個體對放射線敏感程度存在差異有關(guān)〔2〕。評估放療的敏感性有利于預(yù)測腫瘤對放射線反應(yīng)，合理選擇放療方法，從而提高腫瘤放射治療的效果。p53屬于抑癌基因，過度表達可導致腫瘤細胞放射抗拒。本文分析老年宮頸癌患者HPV16-E6、p53表達及與放療敏感性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2015年11月至2016年11月山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院老年宮頸癌患者40例，年齡61～76歲，平均(66.72±2.03)歲；宮頸癌國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：ⅡA期11例，ⅡB期29例。納入標準：①經(jīng)組織病理學確診為宮頸癌；②經(jīng)腹部B超、X線胸片、CT或磁共振成像(MRI)檢查，證實無遠處轉(zhuǎn)移；③首次治療為單純根治性放射治療；④依從性良好，主動配合完成療程，簽署同意書。排除標準：①術(shù)前全身化療、介入化療、插植放療等影響術(shù)后病理放射敏感性評價結(jié)果；②放療過程中出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)者。

1.2放射治療方法 均接受根治性放射治療，采用可直線加速器6/10 MV X射線進行外照射，盆腔大野前后兩野對穿照射，照射野為(18～20 cm)×(16～20 cm)，2 Gy/次，1次/d，5次/w，盆腔外照射總劑量30 Gy后，將4 cm寬鉛塊遮擋照射野，保護直腸和膀胱，同時進行后裝腔內(nèi)放療，6 Gy/次，1次/w，后裝劑量控制為36～42 Gy/6～7次，后裝放療當日不行外照射〔3,4〕。

1.3HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表達水平檢測 放療前后均留取癌組織，提出RNA。根據(jù)放療治療結(jié)果，選擇有效組4例(標記1、2、3、4)和無效組2例(標記5、6)為檢測對象，選取放療前后癌組織進行檢查。同一患者取不同部位3處提取RNA，采用1 μg RNA行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得的cDNA作為PCR模板，隨后進行RT-PCR檢測。

1.4HPV16-E6、p53蛋白表達水平檢測 試劑：ABI 1556試劑盒(美國Ambion)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(美國Pierce公司)，分別提取組織蛋白和檢測組織蛋白濃度。蛋白質(zhì)溶液中加入4倍上樣緩沖液，100℃加熱5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)條帶，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉進行1 h封閉，經(jīng)一抗孵育洗膜、二抗室溫培養(yǎng)1 h洗膜后，采用發(fā)光試劑盒檢測熒光。

1.5觀察指標 參考《實體瘤新的療效評價標準》〔5〕中相關(guān)宮頸癌療效判斷標準，完全緩解(CR)：病灶消失，且持續(xù)≥1個月；部分緩解(PR)：病灶最大徑×最大垂直徑減少50%以上，且持續(xù)≥1個月；穩(wěn)定(SD)：病灶最大徑×最大垂直徑減少50%以下，或增加25%以下；進展(PD)：病灶最大徑×最大垂直徑增加25%以上，或有新病灶出現(xiàn)。根據(jù)治療效果分為有效組(CR+PR)29例和無效組(SD+PD)11例。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1放療結(jié)果 CR 11例，PR 18例，SD 6例，PD 5例，總有效率為72.50%。

2.2放療前后HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA水平比較 放療后有效組4例HPV16-E6 mRNA水平(分別為0.243 8±0.003、0.356 7±0.010、0.423 7±0.014、0.247 8±0.017)顯著低于放療前(0.913 5±0.025、0.921 0±0.023、0.902 4±0.024、0.912 3±0.023)，p53 mRNA表達水平(分別為1.897±0.041、1.656±0.042、1.598±0.040、1.698±0.038)顯著高于放療前(1.003±0.063、0.997±0.056、1.005±0.060、1.009±0.063，Plt;0.05)；放療前后無效組2例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA無顯著差異(分別為0.911 1±0.026、0.924 5±0.024 vs 0.879 1±0.025、0.924 6±0.026；0.979±0.062、1.003±0.063 vs 1.048±0.061、0.998±0.064，Pgt;0.05)。

2.3放療前后HPV16-E6、p53蛋白表達水平比較 放療前有效組和無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平無顯著差異(Pgt;0.05)，放療前后無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平無顯著差異(Pgt;0.05)，放療后有效組HPV16-E6蛋白水平顯著低于放療前、無效組，p53蛋白表達水平顯著高于放療前、無效組(Plt;0.05)。見表1。

表1 放療前后有效和無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平比較

與放療前比較：1)Plt;0.05；與無效組比較：2)Plt;0.05

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道〔6〕，全世界每年新增宮頸癌44萬人次，發(fā)展中國家占80%以上。50～60歲年齡段婦女是宮頸癌高發(fā)人群。宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程十分復(fù)雜，涉及多種癌基因、抑癌基因異常。研究顯示HPV感染與宮頸癌發(fā)生有關(guān)。HPV屬于一種雙鏈、右手螺旋、嗜上皮性的DNA病毒〔7〕，高危型HPV包括HPV16、HPV18，是宮頸癌發(fā)生的獨立危險因素，可抑制抑癌基因表達，促進增殖基因表達，與潛在的惡性生物學行為有關(guān)。張莉華等〔8〕研究顯示，HPV16-E6參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程。E6轉(zhuǎn)化基因及產(chǎn)物是HPV16致癌的關(guān)鍵，但有關(guān)宮頸組織惡性轉(zhuǎn)化機制尚未完全明確。HPV感染所致的高級鱗狀上皮內(nèi)病變中E6、E7蛋白表達水平增高，提示E6、E7表達與細胞惡性病變有關(guān)〔9〕。廖百花等〔10〕認為RNA干擾可抑制HPV復(fù)制，研究結(jié)果表明小鼠宮頸癌細胞瘤體經(jīng)靶向轉(zhuǎn)染HPV16-siRNA后，HPV16-DNA明顯降低，抑制了HPV-DNA的復(fù)制，減緩腫瘤生長速度。龍小佳等〔11〕研究表明，HPV16-E6蛋白表達升高、p53蛋白表達降低可導致口腔癌發(fā)生發(fā)展。p53是一種抑癌基因〔12〕，其基因突變參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。HPV16-E6蛋白與野生型p53蛋白結(jié)合，改變p53蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能，引起p53誘導G1期阻滯減弱，導致病毒進入S期，一旦細胞增殖失控，將形成腫瘤。

放療過程中放射線將細胞DNA雙鏈斷裂(DSB)，起到殺死腫瘤細胞的目的〔13〕。由于細胞具有不同程度的DNA損傷修復(fù)能力，細胞照射后DNA修復(fù)能力將影響放療的效果。細胞修復(fù)能力與DSB修復(fù)蛋白功能、活性、蛋白自身等因素決定〔14〕。目前多數(shù)學者試圖通過改進放療技術(shù)或應(yīng)用化療藥物增敏等提高放療效果，但宮頸癌內(nèi)在放射敏感性決定了放療療效。張欣欣等〔15〕研究顯示，治療前患者血紅蛋白(Hb)含量、腫瘤大小、分化程度、病理類型等是影響宮頸癌放療敏感性的因素。李雪梅等〔16〕研究表明，CT灌注參數(shù)血容量、表面通透性可評估宮頸癌患者放化療敏感性。傳統(tǒng)預(yù)測腫瘤放療敏感性方法是在整體或細胞水平上進行，無法為治療、評價預(yù)后提供足夠數(shù)據(jù)。眭鴻穎等〔17〕研究結(jié)果顯示，p53蛋白與宮頸癌放療敏感性有相關(guān)性，可作為早期宮頸癌放療敏感性的預(yù)測指標。野生型p53可導致細胞凋亡，一旦p53突變，細胞凋亡將減少，對放療產(chǎn)生抗拒，降低放療敏感性。HPV E6基因可與突變的p53基因結(jié)合，在突變p53基因發(fā)揮作用前滅活，降低p53突變患者惡性病變風險。王媛等〔18〕研究顯示，以HPV-18為主的HPV感染可能影響宮頸癌放化療敏感性。童婷婷等〔19〕研究結(jié)果表明，p53高表達與宮頸癌放療抗拒有關(guān)，HPV DNA多重感染的宮頸癌患者對放療敏感性較差。HPV病毒反復(fù)感染，經(jīng)整合入宿主染色體，編碼HPV16-E6蛋白，結(jié)合p53蛋白核心區(qū)，喪失p53對細胞周期調(diào)控作用，導致細胞復(fù)制失控，惡性克隆性增殖。梁少強等〔20〕研究表明，CCND1基因G870A位點多態(tài)性可作為高危型HPV相關(guān)宮頸癌放療敏感性的預(yù)測指標。

本研究提示檢測HPV16-E6、p53表達水平不僅有利于確診宮頸癌，還能判定宮頸癌放療敏感性。隨著立體定向適形、調(diào)強放療技術(shù)的不斷發(fā)展，放療過程中可更好地保護正常組織，使得腫瘤細胞得到更高的照射劑量。宮頸癌放療敏感性較差的患者可通過調(diào)節(jié)HPV16-E6、p53基因表達，增強放療敏感性，提高臨床治療效果。

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〔2017-08-29修回〕

(編輯 苑云杰)

R737.33

A

1005-9202(2017)22-5622-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.062

王慶西(1963-)，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗研究。