張瑞彪 羅永偉 石秋艷

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)分泌科，河北 唐山 063200)

不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達及白細胞介素-2、-10水平的影響

張瑞彪 羅永偉1石秋艷2

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬曹妃甸區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)分泌科，河北 唐山 063200)

目的觀察實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE) 大鼠不同發(fā)病階段脊髓內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB表達及血清白細胞介素(IL)-2、IL-10的水平變化及不同劑量阿托伐他汀鈣對其影響。方法以50%豚鼠全脊髓勻漿誘導(dǎo)Wistar大鼠EAE致病模型，采用量化評分法，比較不同劑量阿托伐他汀鈣對 EAE大鼠脊髓中 NF-κB表達及對血清IL-2、IL-10的影響。結(jié)果高劑量阿托伐他汀鈣可降低血清IL-2水平，升高IL-10水平，下調(diào)NF-κB 在脊髓中的表達(Plt;0.05)，延長EAE大鼠發(fā)病的潛伏期，降低EAE大鼠神經(jīng)功能評分。結(jié)論高劑量阿托伐他汀鈣能顯著改善EAE大鼠病情程度及調(diào)節(jié)血清IL-2、IL-10水平。

阿托伐他汀鈣；自身免疫性腦脊髓炎；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；白細胞介素-2；白細胞介素-10

多發(fā)性硬化(MS)是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，其主要病理過程表現(xiàn)為自體免疫反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)軸突損傷及神經(jīng)纖維髓鞘脫失等〔1〕。本文探討不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠脊髓內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB表達及血清白細胞介素(IL)-2、IL-10水平。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雌性Wistar大鼠58只，6～8 w，體重160～200 g，健康，清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。豚鼠8只，雌雄各半，350～390 g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，健康，清潔級。

1.2模型動物制備方法 我們按照徐玉等〔2〕方法制備豚鼠全脊髓勻漿，予10%水合氯醛4 ml注射于豚鼠腹腔內(nèi)，麻醉成功后處死，立即冰上剝離脊膜，取出脊髓，按1 g脊髓+1 ml生理鹽水比例配比后，用超聲細胞粉碎儀制成50%全脊髓勻漿，加入等量含4%卡介苗的完全福氏佐劑充分混合至油包水乳劑，乳化后按0.5 ml/只4 h內(nèi)注射于大鼠四足墊內(nèi)皮下，誘發(fā)建立大鼠EAE模型。

1.3藥物及試劑 阿托伐他汀鈣由大連輝瑞制藥有限公司提供。IL-2、IL-10試劑盒購自上海天呈生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠NF-κB 抗體及二步免疫組化檢測試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)公司提供。完全福氏佐劑由美國 Sigma 公司提供；卡介苗購自北京生物制品研究所。

1.4實驗動物分組 從58只Wistar大鼠中隨機抽取 10只作為正常對照組，其余經(jīng)過造模成功后隨機分成3組，即EAE組、低劑量組、高劑量組，每組16只，按照時間順序再分成2個亞組，即14 d組和21 d 組，每亞組8只。免疫后當(dāng)日高劑量組予阿托伐他汀鈣8 mg/kg，于每日清晨8點灌胃治療1次。低劑量組予2.5 mg/kg阿托伐他汀鈣每日清晨8點灌胃治療，每日 1 次。EAE組及正常對照組均于同時間段予溫開水灌胃，直至動物處死。

1.5神經(jīng)癥狀評分及造模成功標準 大鼠EAE模型評分法采用較為通用的5分評分法：1分：大鼠尾巴無力下垂；2分：雙后肢輕度無力；3分：嚴重后肢麻痹；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。造模成功標準：神經(jīng)癥狀評分≥1分。

1.6病理標本制作 各組大鼠造模成功及相應(yīng)治療后第14、21天分別處死。10%水合氯醛5 ml腹腔注射，麻醉成功后斷頭處死，迅速完整剝離脊髓，石蠟封片包埋，按照每25 μm 間斷性連續(xù)切片后行常規(guī)HE染色。

1.7血清IL-2、IL-10及NF-κB陽性細胞的測定 大鼠處死后立即采心血2 ml，3 000 r/min離心后獲取血清，-70℃冰箱保存。血清IL-2、IL-10的測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法。試劑盒購自上海天呈生物技術(shù)有限公司，由實驗室工作人員嚴格按照試劑盒說明進行測定。NF-κB陽性細胞采用免疫組化法檢測，由實驗室專業(yè)人員嚴格按照試劑盒說明操作，同時設(shè)陰性對照。取大鼠脊髓切片在顯微鏡下計數(shù)每張片內(nèi)隨機5個高倍視野(×400)NF-κB陽性細胞數(shù)，NF-κB的表達以該片陽性細胞數(shù)總和/5表示，取10片平均值作統(tǒng)計學(xué)處理。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件進行χ2及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)癥狀評分及死亡情況 正常對照組大鼠各時間段均無發(fā)病及死亡情況發(fā)生。其余各組7～13 d發(fā)病，部分大鼠癥狀呈進展性加重，少數(shù)病情緩解后復(fù)發(fā)，部分大鼠死亡。高劑量組病情明顯輕于低劑量組及EAE組，同日神經(jīng)功能評分明顯低于上述兩組，發(fā)病率及死亡率亦明顯低于上述兩組，見表1。

2.2各組血清炎癥因子及NF-κB 標記的陽性細胞 發(fā)病后14 d EAE組血清IL-2水平明顯高于正常對照組，發(fā)病21 d較14 d時有所降低，其中兩個時間段高劑量組均低于低劑量組及EAE組，而IL-10則呈反方向變化，EAE組及低劑量組發(fā)病14～21 d均低于正常對照組，而高劑量組則明顯升高，高于上述三組。NF-κB 陽性細胞數(shù)量于14 d后明顯增多，到21 d陽性細胞數(shù)又逐漸減少，兩個時間段均高于正常對照組(Plt;0.05)。高劑量組大鼠在免疫后14、21 d，NF-κB 陽性細胞數(shù)明顯低于EAE組及低劑量組(Plt;0.05)。見表2。

表1 各組EAE發(fā)病情況及病情評分

與正常對照組比較：1)Plt;0.05；與EAE組及低劑量組比較：2)Plt;0.05，下表同

表2 各組不同時間段血清炎癥因子水平及NF-κB表達情況

3 討 論

MS是一種自身免疫性炎性脫髓鞘性疾病，多種細胞因子及自由基在其疾病發(fā)展過程中起著重要作用，有研究報道，自由基清除劑依達拉奉能有效緩解MS癥狀〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)CD4+Th1細胞在EAE發(fā)病過程中起到了主要的介導(dǎo)作用〔4〕。CD4+細胞分為Th1和Th2兩個亞型。兩個亞型分別分泌不同炎癥因子，在整個炎癥反應(yīng)中扮演不同角色。Th1型細胞因子如IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，能激活巨噬細胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生及進展，導(dǎo)致并促進神經(jīng)髓鞘的損傷，對神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變的產(chǎn)生起著極為重要作用；Th2型細胞介導(dǎo)的細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10等，可以抑制Th1型細胞因子，并通過下調(diào)血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞的應(yīng)急狀態(tài)參與炎癥反應(yīng)的修復(fù)，對神經(jīng)纖維脫髓鞘起到保護作用〔5〕。因此，Th1/Th2之間的動態(tài)平衡是機體免疫平衡、自身防御、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制。已有研究表明MS患者及EAE模型中存在Th1/Th2型細胞因子的失衡，維持Th1/Th2型細胞因子的動態(tài)平衡已成為研究MS發(fā)病及臨床轉(zhuǎn)歸的新策略之一，同時NF-κB通路是參與上述炎癥因子調(diào)控的重要信號系統(tǒng)，在EAE免疫調(diào)節(jié)和炎癥發(fā)展中具有重要作用〔6〕。他汀類藥物是目前臨床的最常用的一類調(diào)脂藥物，而阿托伐他汀作為最有效的他汀類調(diào)脂藥物之一，不僅可以穩(wěn)定動脈硬化斑塊，且可有效地降低血超敏C反應(yīng)蛋白等炎癥因子〔7〕。他汀類藥可以減少白細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的移動，同時調(diào)節(jié)T細胞和B細胞的趨化因子和黏附因子，減少誘導(dǎo)T細胞激活的黏附分子的表達，下調(diào)T細胞和 B細胞趨化因子的受體〔8〕，其抗炎癥機制可能是通過抑制EAE大鼠Th1細胞，阻斷類異戊二烯中間代謝產(chǎn)物的生成，進而減少干擾素(IFN)和TNF-α的水平，從而維持Th1/Th2的動態(tài)平衡〔9〕。王淑歌等〔10〕研究顯示阿托伐他汀可對EAE大鼠產(chǎn)生影響。

本實驗提示高劑量阿托伐他汀鈣具有免疫雙向調(diào)節(jié)作用，可能通過抑制NF-κB 陽性細胞增殖活化過程，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥反應(yīng)，因此利于EAE的恢復(fù)。林述凱等〔11，12〕也有研究證明，阿托伐他汀可促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞的增生，從而生成多種抗炎癥因子，這些抗炎癥因子能有效減低神經(jīng)髓鞘的損傷，可有效減輕發(fā)病癥狀，有利于 EAE 的恢復(fù)。

1郝海光，李紅艷，張曉丹，等.獨活治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的免疫學(xué)機制研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2012；23(10)：2407-10.

2徐 玉，劉瑞春，王 穎，等.Wistar大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志，2007；15(6)：415-8.

3梁江紅，陳 琳.依達拉奉對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的保護作用〔J〕.現(xiàn)代診斷與治療,2012；23(8)：1116-7.

4朱振國，王新施，陳艷艷，等.3種大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的差異〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志，2013；42(2)：34-7.

5厲 芳，鄭榮遠，張正學(xué)，等.阿米洛利對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細胞因子表達的影響〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2012；20(2)：121-5.

6侯紹蔚，劉岳婷，郭敏芳.鹽酸法舒地爾治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的潛能與抗炎作用〔J〕.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2012；29(2)：126-34.

7劉 威，呂 娟，劉榮麗，等.阿托伐他汀對腦梗死并發(fā)頸動脈粥樣硬化斑塊及C反應(yīng)蛋白的影響〔J〕.中國實用神經(jīng)疾病雜志，2014；17(12)：42-3.

8田廣平，石秋艷，王淑歌.阿托伐他汀對EAE大鼠脊髓ICAM-1和TGF-β1表達的影響〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011；10(10)：979-82.

9Mizrachi K，Aricha R，F(xiàn)eferman T，etal.Involvement of phosphodiesterases in autoimmune diseases〔J〕.J Neuroimmunol，2010；220(1-2)：43-51.

10王淑歌，林述凱，石秋艷，等.阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的影響〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011；46(10)：997-1000.

11林述凱，石秋艷，王淑歌，等.阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)NF-κB表達的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011；37(4)：607-11.

12石秋艷，張瑞彪，田廣平.不同劑量阿托伐他汀鈣對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓內(nèi)NF-κB表達及血清炎性因子的影響〔J〕.疑難病雜志，2014；13(1)：70-3.

〔2016-08-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R744.3

A

1005-9202(2017)22-5562-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.033

1 河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院病案室 2 河北聯(lián)合大學(xué)神經(jīng)重癥科

張瑞彪(1973-)，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事慢性炎癥反應(yīng)與神經(jīng)內(nèi)科疾病相關(guān)性研究。