張 妍 阮連國 曾友玲 曾 潔
(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,湖北 武漢 430032)
皂刺粗黃酮對小鼠移植U14宮頸癌細胞生長的影響及機制
張 妍 阮連國1曾友玲 曾 潔
(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,湖北 武漢 430032)
目的觀察皂刺粗黃酮對小鼠移植U14宮頸癌細胞的影響,并探討其可能機制。方法制備皂刺粗黃酮浸膏,建立小鼠宮頸癌模型,將小鼠分為觀察組1(皂刺粗黃酮低劑量)、觀察組2(皂刺粗黃酮中劑量)、觀察組3(皂刺粗黃酮高劑量)、環(huán)磷酰胺組和對照組(生理鹽水組),稱取小鼠始體重、終體重、瘤重,計算抑瘤率和生命延長率,放射免疫法測定血清白細胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平;免疫組化SP法測定腫瘤組織中p53和增殖細胞核抗原(PCNA)表達。結(jié)果觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的瘤重低于對照組(Plt;0.05),但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的抑瘤率和生命延長率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的存活天數(shù)高于對照組(Plt;0.05),但低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α高于環(huán)磷酰胺組和對照組(Plt;0.05)。觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的p53和PCNA表達低于對照組(Plt;0.05),但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);環(huán)磷酰胺組小鼠的p53和PCNA表達低于對照組(Plt;0.05)。結(jié)論皂刺粗黃酮可升高血清IL-2和TNF-α水平、促進宮頸癌組織中p53和PCNA表達,抑制小鼠移植U14宮頸癌的生長。
皂刺粗黃酮;U14細胞;宮頸癌
尋找毒副作用小、療效顯著的中藥對宮頸癌的治療具有重要意義。皂刺是傳統(tǒng)的中藥材,具有殺蟲、排毒、消腫等功效,具有抗腫瘤作用〔1,2〕。黃酮類化合物毒性比較低,具有抗致癌物質(zhì)致癌以及抑制腫瘤發(fā)生等抗腫瘤作用〔3〕,但不同黃酮類化合物的抗腫瘤作用不完全相同。本文提取皂刺粗黃酮治療小鼠移植U14宮頸癌,觀察其對宮頸癌的影響并探討可能機制。
1.1材料 實驗動物:6~8周齡、雌性、昆明小鼠,體重17~23 g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,動物許可證號:SCXK(京)2004-0001。瘤株及主要試劑:宮頸癌U14細胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所),環(huán)磷酰胺(山西泰盛制藥有限公司),鼠抗p53(突變型)單克隆抗體及鼠抗增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、白細胞介素(IL)-2和腫瘤壞死因子(TNF-α)放射免疫試劑盒(美國Sigma公司)等。
1.2制備皂刺粗黃酮浸膏 稱取皂刺醇2 kg粉碎,加入95%乙醇提取2次,將2次提取液減壓濃縮得到皂刺醇浸膏。將皂刺醇浸膏懸浮到水中,濾除不溶物得到水溶物,加入石油醚分層,將石油醚溶解物去除,分步萃取4次得到水相,加入乙酸乙酯,再分步萃取4次得到乙酸乙酯相,減壓濃縮得到皂刺粗黃酮浸膏。采用《天然藥物化學(xué)》中黃酮類化合物顯色反應(yīng)對皂刺粗黃酮進行顯色定性鑒定。
1.3建立小鼠宮頸癌模型 將U14宮頸癌細胞株從液氮中取出,水浴融化,離心,棄去上清液,臺盼藍染色計數(shù)活細胞率超過95%時,將細胞調(diào)整為1×107個/ml,取0.3 ml U14細胞接種到小鼠腹腔內(nèi),在小鼠體內(nèi)傳代10 d,無菌條件下取小鼠體內(nèi)U14細胞,實體瘤模型取0.2 ml(2×106個/ml)接種到小鼠右前肢腋下,腹水瘤模型取0.2 ml細胞注射到腹腔內(nèi),接種成功率為100.0%。
1.4分組和處理 將70只昆明小鼠按照隨機數(shù)字法分為觀察組1、觀察組2、觀察組3、環(huán)磷酰胺組和對照組,每組14只。觀察組1、觀察組2、觀察組3分別給予皂刺粗黃酮70、140、280 mg/kg三種劑量灌胃(0.1 ml/10 g),給藥容量0.2 ml/10 g;環(huán)磷酰胺組給予環(huán)磷酰胺0.1 ml/10 g腹腔注射;對照組給予0.2 ml/10 g生理鹽水灌胃;各組小鼠均每天給藥1次,共10 d。停藥后第2天實體瘤各組按要求取血測量血清IL-2和TNF水平,然后處死各組小鼠。
1.5血清IL-2和TNF-α水平測定 將實體瘤各組小鼠眼球血離心留取血清,采用放射免疫法測定血清IL-2和TNF-α水平。
1.6測定實體瘤抑瘤率及腹水瘤生命延長率 實體瘤各組小鼠處死后取瘤塊稱重,計算抑瘤率。腹水瘤各組小鼠自然死亡,觀察各組小鼠存活天數(shù),計算小鼠生命延長率,生命延長率=(藥物治療組存活天數(shù)-對照組存活天數(shù))/對照組存活天數(shù)×100%。
1.7測定腫瘤組織中p53和PCNA表達 將實體瘤小鼠的瘤體進行石蠟包埋,免疫組化SP法測定腫瘤組織中p53和PCNA表達情況,以細胞核呈棕黃色顆粒染色為陽性,取8個高倍視野計算100個腫瘤細胞中染色陽性細胞,求平均值。
1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件,多組均數(shù)之間比較采用方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗。
2.1各組小鼠宮頸癌抑制率比較 5組小鼠始體重和終體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05),瘤重和抑瘤率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05),其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的瘤重低于對照組(Plt;0.05),但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的抑瘤率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3之間瘤重和抑瘤率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。見表1。
表1 各組小鼠宮頸癌抑制率比較
與環(huán)磷酰胺組比較:1)Plt;0.05;與對照組比較:2)Plt;0.05;下表同
2.2各組小鼠存活天數(shù)和生命延長率比較 5組小鼠存活天數(shù)和生命延長率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05),其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的存活天數(shù)高于對照組(Plt;0.05),但低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的生命延長率低于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05)。見表2。
2.3各組小鼠血清IL-2和TNF-α比較 5組小鼠血清IL-2和TNF-α比較有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05),其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α高于環(huán)磷酰胺組和對照組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠血清IL-2和TNF-α比較無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05),環(huán)磷酰胺組和對照組小鼠血清IL-2和TNF-α比較無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。見表2。
2.4各組小鼠p53和PCNA表達比較 5組小鼠p53和PCNA表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05),其中觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠的p53和PCNA表達低于對照組(Plt;0.05),但高于環(huán)磷酰胺組(Plt;0.05);環(huán)磷酰胺組小鼠的p53和PCNA表達低于對照組(Plt;0.05);觀察組1、觀察組2、觀察組3小鼠之間p53和PCNA表達比較無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。見表2。
表2 各組小鼠存活天數(shù)、生命延長率、IL-2、TNF-α及P53和PCNA表達比較
黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗炎、保肝、降血脂、降膽固醇等作用,在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性、抗病毒等發(fā)面具有顯著活性〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮對前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌等多種癌癥具有抑制作用,能夠誘導(dǎo)癌細胞分化,抑制癌細胞生長和增殖〔5~8〕。紅三葉草異黃酮對乳腺癌等有抑制作用〔9〕。皂刺粗黃酮對肺癌等癌癥有抑制作用〔10〕。本文表明皂刺粗黃酮對宮頸癌具有抑制作用,但其效果沒有環(huán)磷酰胺顯著。免疫調(diào)節(jié)是中藥抗腫瘤的最普遍的機制。IL-2對殺傷細胞的殺傷能力和T細胞的增殖分化具有重要作用,在正常機體免疫具有正向調(diào)節(jié)作用,在瘤體內(nèi)IL-2系統(tǒng)明顯被抑制〔11,12〕。TNF-α是機體重要的炎癥反應(yīng)和機體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子,在促進創(chuàng)傷組織愈合、抗腫瘤、抗感染等方面具有重要作用,其活性可直接殺傷腫瘤細胞〔13〕。本研究表明,皂刺粗黃酮有升高小鼠血清IL-2和TNF-α水平的作用。野生型p53為腫瘤抑制基因,p53基因發(fā)生突變時其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,使p53蛋白表達增強,突變型p53的腫瘤抑制活性喪失,在DNA復(fù)制水平調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長,是導(dǎo)致腫瘤異常增殖的重要因素〔14,15〕。PCNA存在于細胞核內(nèi),和DNA的復(fù)制關(guān)系密切,調(diào)節(jié)細胞由DNA合成前期向DNA合成期過度,與腫瘤細胞的增殖關(guān)系比較密切〔16,17〕。本研究結(jié)果表明,皂刺粗黃酮對小鼠宮頸癌組織中p53和PCNA表達有促進作用。由此可見,皂刺粗黃酮抑制小鼠移植U14宮頸癌的機制可能與皂刺粗黃酮升高血清IL-2和TNF水平、促進宮頸癌組織中p53和PCNA的表達有關(guān)。
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〔2017-03-10修回〕
(編輯 徐 杰)
R71
A
1005-9202(2017)22-5553-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.029
武漢市衛(wèi)計委基金項目(WZ16C23)
1 武漢市醫(yī)療救治中心
阮連國(1975-),男,博士,副主任醫(yī)師,主要從事急救醫(yī)學(xué)研究。
張 妍(1979-),女,碩士,主治醫(yī)師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合婦科疾病研究。