肖韓艷 馮 瑩 徐甜穎 張本卓 袁春華 畢鵬翔

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

孕酮對(duì)β淀粉樣蛋白致傷神經(jīng)干細(xì)胞存活及其Caspase-3表達(dá)的影響

肖韓艷 馮 瑩 徐甜穎 張本卓 袁春華 畢鵬翔1

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的研究孕酮(PROG)對(duì)β淀粉樣蛋白(Aβ)1～40致傷的海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖及其Caspase-3表達(dá)的影響。方法應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)不同濃度PROG對(duì)Aβ1～40致傷神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響，Western印跡法檢測(cè)PROG干預(yù)后Aβ1～40致傷的神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3活性的變化及對(duì)致傷神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果PROG能劑量依賴(lài)地對(duì)抗Aβ1～40致傷后引起的大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率降低。結(jié)論1 pmol/L及10 pmol/L PROG在48 h時(shí)對(duì)Aβ1～40致傷的海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖保護(hù)作用最強(qiáng)，10 pmol/L濃度PROG在7 d時(shí)對(duì)Aβ1～40致傷的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡保護(hù)作用最強(qiáng)。

孕酮;β-淀粉樣蛋白;神經(jīng)干細(xì)胞;神經(jīng)毒性;阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制不完全明確，目前有多種假說(shuō)提示其可能的發(fā)病原因，其中β淀粉樣蛋白(Aβ)瀑布假說(shuō)是較公認(rèn)的〔1〕。該假說(shuō)提示Aβ的生成及清除失衡是導(dǎo)致神經(jīng)元變性及癡呆發(fā)生的始動(dòng)因素〔2〕。本實(shí)驗(yàn)建立了Aβ1～40致傷的AD干細(xì)胞模型給予濃度梯度孕酮(PROG)，研究不同濃度PROG對(duì)AD干細(xì)胞模型存活及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑及儀器 雄性Wistar大鼠，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，上海艾研生物科技有限公司)、Aβ1～40(Biosouxee公司)；二抗(進(jìn)口分裝)；Nestin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)；酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀 E1X800(BioTEK公司)；IBE2003倒置熒光顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

1.2方法 取出生72 h內(nèi)Wistar大鼠海馬組織加入培養(yǎng)液(DMEM/F12 1∶1，2%B27，bFGF 20 μg/L，表皮生長(zhǎng)因子20 μg/L)5 ml，每8天傳代；行Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)，Nestin 陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。取第3代神經(jīng)干細(xì)胞懸液，接種于96孔板，分別加入PROG終濃度為：0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 pmol/L組，孵育30 min后加入Aβ1～405 μmol/L，并設(shè)立空白對(duì)照組(培養(yǎng)基中加入等量的培養(yǎng)液)和AD模型組(Aβ1～405 μmol/L加入傳代3次后的神經(jīng)干細(xì)胞中)。上述各組孵育0、12、24、48、72 h、7 d各時(shí)間點(diǎn)行MTT法檢測(cè)，在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d時(shí)間點(diǎn)行Western印跡檢測(cè)。

1.3MTT法 加入MTT溶液，使其培養(yǎng)液中的終濃度為5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去加入溶解液二甲基亞砜(DMSO)200 μl振蕩10 min使其充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)490 nm檢測(cè)每孔的OD值。每組設(shè)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4Western印跡檢測(cè)海馬神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3的表達(dá) 倒去96孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次，每孔加入細(xì)胞裂解液100 μl，冰上孵育20 min，將細(xì)胞裂解物刮下、移入 EP 管中，4℃ 12 000 r/min離心5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移入EP管，用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液，配膠，上樣，電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗體(1∶800)4℃孵育過(guò)夜，PBS-T洗膜4次，每次15 min，加二抗(1∶2 000)，搖勻，室溫孵育1.5 h，PBS-T洗膜4次，每次15 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)，感光膠片記錄，Image J 軟件分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞存活率比較 隨著PROG濃度的增加，在490 nm處的吸光度也增加，反映細(xì)胞相應(yīng)數(shù)目的增加，并有一定的劑量依賴(lài)性。PROG在不同時(shí)間點(diǎn)均可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，與空白對(duì)照組及其他濃度組相比，在48 h時(shí)1.00 pmol/L和10.00 pmol/L PROG促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，但二者無(wú)明顯差別(Pgt;0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組Caspase-3表達(dá)比較 各組孵育各時(shí)間點(diǎn)(0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d)后，與空白對(duì)照組相比，Caspase-3 活性表達(dá)逐漸增加(Plt;0.05)，且在2 d達(dá)到高峰(Plt;0.01)。與AD模型組相比，PROG組在各時(shí)間點(diǎn)均可降低 Caspase-3 的表達(dá)(Plt;0.05)，特別在7 d這個(gè)時(shí)間點(diǎn)更加明顯(Plt;0.01)，且隨PROG濃度增加Caspase-3下降越明顯，10.00 pmol/L下降最明顯，100.00 pmol/L反而輕度上升。而空白對(duì)照組在0 h、1 d、2 d、3 d、7 d、14 d、21 d Caspase-3活性未發(fā)生明顯改變(Pgt;0.05)。

表1 不同濃度PROG對(duì)Aβ1～40致傷神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響值,n=3)

與空白對(duì)照組比較：1)Plt;0.05；與AD模型組比較：2)Plt;0.05；與其他濃度其他時(shí)間點(diǎn)比較：3)Plt;0.05，下表同

表2 不同濃度PROG對(duì)Aβ1～40致傷海馬神經(jīng)干細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響

3 討 論

干細(xì)胞是具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過(guò)不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類(lèi)細(xì)胞〔3〕。神經(jīng)干細(xì)胞具有自更新能力，可以穩(wěn)定增殖。本實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組也證實(shí)了這點(diǎn)。Aβ聚集是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，代謝異常引起Aβ寡聚體沉積形成斑塊〔4〕，導(dǎo)致繼發(fā)炎癥反應(yīng)、引起氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞功能，出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)、軸突損傷和突觸丟失等級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔5〕，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡誘發(fā)臨床出現(xiàn)癡呆癥狀。Aβ是AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活因素，異常沉積Aβ為免疫原、激活腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞、釋放炎癥介質(zhì)，通過(guò)免疫炎癥應(yīng)答對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用〔6〕，損傷神經(jīng)細(xì)胞。另外，神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性反應(yīng)加劇Aβ的產(chǎn)生和沉積，形成惡性循環(huán)和級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)〔7〕。同時(shí)炎癥介質(zhì)及各種神經(jīng)毒性物質(zhì)抑制AD患者內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，影響內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)損傷組織的修復(fù)。

細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及機(jī)體防御功能和正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)提示在正常神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程中也存在凋亡，細(xì)胞凋亡參與了AD患者神經(jīng)元退行性病變的過(guò)程。而PROG可以保護(hù)Aβ致傷的神經(jīng)干細(xì)胞、抑制其凋亡?？赡軝C(jī)制是PROG可降低核因子-κB及其在靶基因的表達(dá)、控制炎癥作用放大、下調(diào)多種酶的基因表達(dá)、進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3、Bax和AKT蛋白在創(chuàng)傷后被激活，這些酶類(lèi)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序〔8〕，PROG可以降低這些物質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)阻止細(xì)胞色素C激活Caspase-3，并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2等的表達(dá)。PROG可以上調(diào)創(chuàng)傷后抗凋亡蛋白細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的表達(dá)水平〔9〕。PROG可減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PROG可以下調(diào)Aβ致傷的海馬神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

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〔2016-11-04修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R741.02

A

1005-9202(2017)22-5551-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.028

黑龍江省中醫(yī)科研項(xiàng)目(2HY16-019)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目ZS201521

1 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

畢鵬翔(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

肖韓艷(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，講師，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。