劉文宗 何 譜 邵明亮 張 巍

(石家莊市第五醫(yī)院胸腹外科，河北 石家莊 050021)

整合素連接激酶經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移

劉文宗 何 譜 邵明亮1張 巍2

(石家莊市第五醫(yī)院胸腹外科，河北 石家莊 050021)

目的探討整合素連接激酶(ILK)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。方法利用基因轉(zhuǎn)染建立過(guò)表達(dá)ILK基因的HGC-27及KATO Ⅲ胃癌細(xì)胞株；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(CCK)8和Transwell實(shí)驗(yàn)研究上調(diào)ILK基因表達(dá)對(duì)HGC-27及KATO Ⅲ細(xì)胞增殖和遷移能力的作用；Western 印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)ILK基因表達(dá)是否可影響HGC-27及KATOⅢ細(xì)胞Akt及p-Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)果上調(diào)ILK基因表達(dá)可顯著促進(jìn)HGC-27及KATO Ⅲ細(xì)胞的增殖和遷移能力；上調(diào)ILK基因表達(dá)可明顯上調(diào)HGC-27及KATO Ⅲ細(xì)胞p-Akt蛋白水平。結(jié)論ILK經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路參與及影響胃癌細(xì)胞的致癌潛能。

胃癌；整合素連接激酶；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路

胃癌是人類(lèi)消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其在所有惡性腫瘤中的發(fā)病及病死率高居第二位，僅次于肺癌〔1〕。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，據(jù)研究表明，僅2015年我國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率就分別高達(dá)679.1/10 萬(wàn)和498.0/10 萬(wàn)〔2〕。臨床醫(yī)治胃癌的主要手段是外科手術(shù)結(jié)合放、化療的綜合療法，但隨著人們對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的不斷探索，化療聯(lián)合分子靶向治療已逐步應(yīng)用于胃癌的臨床治療并取得良好療效〔3,4〕。整合素連接激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可經(jīng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響及參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物行為〔5～7〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建上調(diào)ILK基因表達(dá)的胃癌細(xì)胞株，研究該基因?qū)ξ赴┘?xì)胞惡性表型的影響及其相關(guān)機(jī)制，從而為胃癌臨床診斷確立新的分子標(biāo)記物，并可為胃癌治療提供全新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞及主要材料 RPMI1640 培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))，胎牛血清(NQBB，美國(guó))，人胃癌細(xì)胞HGC-27及KATO Ⅲ(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，中國(guó))，Transwell小室(Corning，美國(guó))，兔抗ILK多克隆抗體、鼠抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、兔抗蛋白激酶(PK)B單克隆抗體及兔抗磷酸化PK(p-PK)B多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))，鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG(博士德，中國(guó))；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(CCK-8，博士德，中國(guó))。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 分別將HGC-27及KATO Ⅲ細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板各孔中(1.5×105個(gè)/孔)，細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含5%熱滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640；待細(xì)胞培養(yǎng)至24 h，移除培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，并向各孔中分別加入0.5 ml ILK質(zhì)粒和空質(zhì)粒病毒轉(zhuǎn)染液；待上述細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素(終濃度為5 ng/μl)進(jìn)行篩選；于篩選后7 d，行Wstern印跡實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將ILK質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HGC-27和KATOⅢ細(xì)胞按4×103個(gè)/孔均勻鋪于96孔板各孔，細(xì)胞所用培養(yǎng)基為100 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基；待細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72和96 h，向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，然后將孔板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)得450 nm波長(zhǎng)吸光度。

1.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將ILK質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HGC-27和KATOⅢ細(xì)胞按2×104個(gè)/室均勻鋪于Transwell小室中，小室中培養(yǎng)基為100 μl不含血清的RPMI1640；將小室置于24孔板各孔中，各孔中的培養(yǎng)基為600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640；將孔板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用脫脂棉簽小心擦掉小室內(nèi)表面未遷移過(guò)的細(xì)胞；乙醇結(jié)晶紫染色25 min，自來(lái)水沖洗、晾干后在光學(xué)顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，將50 μg細(xì)胞總蛋白加入12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠泳道中行垂直電泳；待溴酚藍(lán)泳動(dòng)至下層膠下1/3處時(shí)，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；37℃環(huán)境下將膜置于5%脫脂奶中封閉45 min；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)室溫洗膜5 min×4次；4℃環(huán)境下分別用ILK(1∶500)、PCNA(1∶500)、PKB(1∶500)、p-PKB和β-actin(1∶1 000)一抗對(duì)膜孵育過(guò)夜；次日用PBS-T室溫洗膜5 min×4次；37℃環(huán)境下分別用HRP標(biāo)記的二抗對(duì)膜孵育40 min；PBS-T室溫洗膜15 min×4次；向膜上滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑反應(yīng)1～2 min；在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照及計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1過(guò)表達(dá)ILK細(xì)胞的鑒定 嘌呤霉素篩選7 d后，Wstern印跡結(jié)果所示，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HGC-27細(xì)胞(HGC-27-Control)中ILK基因表達(dá)(1.109±0.114)明顯低于ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HGC-27細(xì)胞(HGC-27-ILK，1.970±0.105)。同樣，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KATOⅢ細(xì)胞(KATOⅢ-Control)中ILK基因表達(dá)(0.796±0.108)明顯低于ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KATOⅢ細(xì)胞(KATOⅢ-ILK，1.763±0.255)(均Plt;0.01)，故表明成功創(chuàng)建了上調(diào)ILK基因表達(dá)的胃癌細(xì)胞株。見(jiàn)圖1。

2.2過(guò)表達(dá)ILK增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)所示，HGC-27-Control組細(xì)胞生長(zhǎng)至48、72、96 h后其吸光度值明顯低于HGC-27-ILK組(Plt;0.05)。另外，KATOⅢ-Control組細(xì)胞生長(zhǎng)至72、96 h后其吸光度值明顯低于KATOⅢ-ILK組(Plt;0.05)。這說(shuō)明，上調(diào)ILK基因的表達(dá)可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞HGC-27和KATO Ⅲ的增殖活性。見(jiàn)表1。

2.3過(guò)表達(dá)ILK增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移 Transwell 實(shí)驗(yàn)所示，24 h后HGC-27-Control組與HGC-27-ILK組遷移的細(xì)胞數(shù)〔(51.80±3.70)個(gè)和(63.40±10.36)個(gè)〕差異顯著(Plt;0.05)；KATO Ⅲ-Control組與KATO Ⅲ-ILK組遷移的細(xì)胞數(shù)〔(73.80±7.39)個(gè)和(89.40±11.10)個(gè)〕差異顯著(Plt;0.05)。

2.4過(guò)表達(dá)ILK上調(diào)p-PKB表達(dá) Western 印跡結(jié)果表明，HGC-27-Control中p-PKB基因表達(dá)(0.644±0.116)明顯低于HGC-27-ILK(0.995±0.076)；KATO Ⅲ-Control組p-PKB基因表達(dá)(0.315±0.062)明顯低于KATO Ⅲ-ILK組(0.759±0.105)(均Plt;0.01)。見(jiàn)圖2。

圖1 ILK穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定

組別24h48h72h96hHGC-27-Control組0.4628±0.03640.6598±0.04851.3458±0.09341.9457±0.0732HGC-27-ILK組0.4714±0.02720.8117±0.05841)1.4969±0.07391)2.1543±0.11321)KATOⅢ-Control組0.6350±0.05251.1431±0.04751.5674±0.04852.1330±0.0517KATOⅢ-ILK組0.6649±0.05091.1918±0.10171.6904±0.07062)2.2254±0.06082)

與HGC-27-Control比較：1)Plt;0.05；與KATO Ⅲ-Control比較：2)Plt;0.05

圖2 過(guò)表達(dá)ILK上調(diào)HGC-27和KATOⅢ細(xì)胞p-PKB表達(dá)

3 討 論

ILK是1996年Hannigan等在運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行整合素β1蛋白研究過(guò)程中鑒定出的具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活性的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，該基因位于人類(lèi)染色體的11p15.5-p15.4位置上，可編碼相對(duì)分子量為36 000的功能性蛋白質(zhì)〔8〕。ILK可被整合素及生長(zhǎng)因子等信號(hào)分子經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴(lài)形式而活化，激活的ILK可使其下游分子PKB和糖原合成酶激酶(GSK)3磷酸化，從而介導(dǎo)來(lái)自生長(zhǎng)因子、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)彼此間協(xié)同刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并最終影響細(xì)胞的生理、生化功能〔9〕。人類(lèi)的一些惡性腫瘤如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等都存在ILK 基因的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)水平與腫瘤惡性進(jìn)程、轉(zhuǎn)移程度等臨床病理參數(shù)具有明顯相關(guān)性〔10〕。Oloumi等〔11〕報(bào)道，上調(diào)或活化ILK基因的腫瘤細(xì)胞具有非貼壁生長(zhǎng)活性，并且轉(zhuǎn)移、侵襲和成瘤能力顯著提高。而當(dāng)應(yīng)用RNAi下調(diào)ILK基因表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等惡性表型〔12〕。Liu等〔13〕研究表明，應(yīng)用RNAi下調(diào)卵巢癌細(xì)胞ILK后，凋亡相關(guān)基因如B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達(dá)也被下調(diào)。由此可見(jiàn)，ILK還可調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

PKB又稱(chēng)Akt，它是PI3K/PKB通路的重要信號(hào)分子，PI3K/PKB通路被人們普遍認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵信號(hào)途徑，在腫瘤的惡性發(fā)展中發(fā)揮不可替代的作用。Yamamoto等〔14〕研究結(jié)腸癌發(fā)現(xiàn)，活化的PI3K/Akt途徑可經(jīng)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)致使腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)。當(dāng)應(yīng)用PI3K/PKB途徑靶向小干擾RNA可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲〔15〕。最近的一項(xiàng)研究也報(bào)道了PI3K/PKB在胃癌中的重要作用，當(dāng)將小RNA-196b(miR-196b)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞PI3K/PKB蛋白水平和G0/G1期比值可被上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的增殖、克隆形成及遷移能力也明顯增強(qiáng)〔16〕。同樣，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HGC-27及KATOⅢ胃癌細(xì)胞株過(guò)表達(dá)ILK基因可顯著促進(jìn)其增殖和遷移能力，同時(shí)過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的p-PKB水平也顯著提高。由此表明，與上述RNA-196b實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，ILK可經(jīng)PI3K/AKT途徑參與胃癌發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。該研究成果可幫助人們更深入認(rèn)識(shí)胃癌的分子機(jī)制，從而可為胃癌的臨床診斷和治療提供全新的分子標(biāo)記物和靶點(diǎn)。

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7Persad S,Attwell S,Gray V,etal.Inhibition of integrin-linked kinase (ILK) suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(7):3207-12.

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〔2016-11-13修回〕

(編輯 王一涵)

R735.2

A

1005-9202(2017)22-5536-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.021

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2013326)

1 介入醫(yī)學(xué)科 2 研究中心

張 巍(1976-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤早期診斷研究。

劉文宗(1982-)，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事普外科疾病診治研究。