吳高亮 周偉敏 齊雪亮 胡 涌 黃 驥 郝 超

(江西省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌 330029)

脂多糖介導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路在膀胱癌免疫逃逸中的作用及其機(jī)制

吳高亮 周偉敏 齊雪亮 胡 涌 黃 驥 郝 超

(江西省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌 330029)

目的探討脂多糖介導(dǎo)的Toll樣受體(TLR)4信號(hào)通路活化在膀胱癌(BC)T24細(xì)胞系免疫逃逸中的作用及其機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，使用1 μg/ml的脂多糖分別刺激該細(xì)胞0、6、12、24 h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)量，采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中程序性死亡配體-1(PD-1,又稱(chēng)B7-H1)mRNA的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中B7-H1 蛋白的表達(dá)，分析TLR4表達(dá)與B7-H1 mRNA及其蛋白的相關(guān)性。結(jié)果TLR4陽(yáng)性率隨刺激時(shí)間的增長(zhǎng)而上調(diào)，且在12 h時(shí)達(dá)到最高值，24 h時(shí)表達(dá)略有降低，但仍較高。6、12、24 h時(shí)TLR4陽(yáng)性率與0 h時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示B7-H1 mRNA及蛋白的表達(dá)隨刺激時(shí)間的增長(zhǎng)而上調(diào)，且在12 h時(shí)達(dá)到最高值，24 h時(shí)表達(dá)略有降低，但仍較高。與0 h時(shí)比較，6 h和24 h T24細(xì)胞B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)量增高(Plt;0.05)，12 h 顯著增高(Plt;0.01)。TLR4與B7-H1 mRNA呈正相關(guān)(r=0.785，P=0.002)，TLR4與B7-H1 蛋白呈正相關(guān)(r=0.825，P=0.012)。結(jié)論脂多糖能活化TLR4信號(hào)通路，并上調(diào)B7-H1 mRNA及其蛋白的表達(dá)，可能參與BC細(xì)胞免疫逃逸，為BC的靶向治療提供新思路。

Toll樣受體4；程序性死亡配體-1；蛋白表達(dá)；膀胱癌；免疫逃逸

膀胱癌(BC)是發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，可分為表淺性BC(Ta～1及原位癌Tis)和浸潤(rùn)性BC(T2～4)兩大類(lèi)，其中浸潤(rùn)性BC占總體的80%，具有易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差、術(shù)后生存率較低等特點(diǎn)〔1〕初次治愈后復(fù)發(fā)率高達(dá)70%～80%。Toll樣受體(TLR)4是一種免疫調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答的起始階段，正常情況下僅表達(dá)于機(jī)體免疫細(xì)胞表面，病理狀態(tài)下表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞表面〔2〕。程序性死亡配體(PD)-1又稱(chēng)B7-H1，可以通過(guò)與受體PD-1的結(jié)合對(duì)某些細(xì)胞因子的分泌和T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，或與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸密切相關(guān)〔3〕。目前，關(guān)于TLR4信號(hào)通路和B7-H1在肺癌、套細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞等中的免疫逃逸過(guò)程已有報(bào)道〔4,5〕，但是在BC細(xì)胞中的免疫逃逸機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。本文利用脂多糖介導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路活化，研究TLR4信號(hào)通路和B7-H1在BC免疫逃逸中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞及試劑 人BC細(xì)胞系T24細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))，青霉素、鏈霉素(Sigma公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、培養(yǎng)液 RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone 公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，鼠抗人TLR4單克隆抗體(Biolegend公司)，RT-PCR試劑盒(LifeInvitrogen公司)，PCR引物由LifeInvitrogen公司合成。PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo公司)，B7-H1 ELISA kit(LifeInvitrogen)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)，Real-Time PCR System(model 7500，Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)，PCR System 9700(GeneAmp)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD Model680，Japan),低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5810 R，eppendorf)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、濃度為100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸鏈霉素)，在溫度37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中對(duì)BC T24細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每2 d按照1∶2或1∶3的比例傳代。

1.2.2TLR4信號(hào)通路活化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞，0.25%胰酶消化完全后，加入適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基終止消化，1 500 r/min離心3 min，棄去上清后，以新鮮完全培養(yǎng)液重新懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸浮液稀釋至1.5×105cells/ml，以2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入含有1 μg/ml的脂多糖，繼續(xù)孵育0、6、12和24 h。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4表達(dá) 按時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基終止消化，1 500 r/min離心3 min，棄去上清，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，重復(fù)3次，加入PE標(biāo)記的鼠抗人TLR4單克隆抗體，在4℃的溫度下避光孵育30 min，孵育完畢后，冰PBS洗滌3次，將細(xì)胞團(tuán)塊完全懸浮于冰PBS中，加入200 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4表達(dá)。

1.2.4RT-PCR測(cè)定B7-H1 mRNA表達(dá) 按時(shí)間點(diǎn)取脂多糖孵育結(jié)束的6孔板，棄去上清，加入1 ml/孔的Trizol裂解液，裂解細(xì)胞，按照相分離-沉淀RNA-洗滌RNA-RNA再溶解的步驟，提取各組T24細(xì)胞中總RNA。測(cè)量各組總RNA濃度，分別取等量的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。測(cè)量逆轉(zhuǎn)錄后的各組cDNA濃度，分別取等量的cDNA進(jìn)行RT-PCR，設(shè)定條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min。40個(gè)循環(huán)：95℃ 15 s，60℃ 1 min。B7-H1上游引物序列：5′-GCCGATACAAGCGAATTA-3′，下游引物序列：5′-TCTCAGTGTGCTGGTCTGGTCACAT-3′，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，上游引物序列：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，采用PCR System 9700進(jìn)行分析，運(yùn)用2-△△Ct法相對(duì)定量檢測(cè)各組 mRNA 的表達(dá)量。

1.2.5ELISA測(cè)定B7-H1蛋白表達(dá) 按時(shí)間點(diǎn)取脂多糖孵育結(jié)束的6孔板置于冰上，棄去上清，用冰PBS洗3遍，再加入1 ml/孔的冰PBS，用細(xì)胞刮仔細(xì)完全地刮下細(xì)胞。將刮下的含有細(xì)胞的PBS液轉(zhuǎn)移離心管內(nèi)，3 000 r/min，4℃離心5 min，棄去上清液，加入250 μl/孔的混合裂解液，反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液。測(cè)定牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BCA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣品的總蛋白濃度。各組樣品取等量的總蛋白，按照B7-H1 ELISA試劑盒的規(guī)定步驟處理蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度，根據(jù)測(cè)定的B7-H1蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣品對(duì)應(yīng)的蛋白濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1脂多糖刺激時(shí)間對(duì)TLR4表達(dá)的影響 以1 μg/ml的脂多糖分別刺激T24細(xì)胞0、6、12、24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示TLR4陽(yáng)性率隨刺激時(shí)間的增長(zhǎng)而上調(diào)，且在12 h時(shí)(27.76%，3 551/12 790)達(dá)到最高值，24 h時(shí)(22.49%，3 057/13 590)表達(dá)略有降低，但仍較高。6 h(14.65%，1 856/12 672)、12 h、24 h時(shí)TLR4陽(yáng)性率與0 h(3.55%，533/15 024)時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

2.2B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果 B7-H1 mRNA、蛋白的表達(dá)隨刺激時(shí)間的增長(zhǎng)而上調(diào)，且在12 h時(shí)達(dá)到最高值，24 h時(shí)表達(dá)略有降低，但仍較高。與0 h時(shí)比較，6 h和24 h T24細(xì)胞B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)量增高(Plt;0.05)，12 h顯著增高(Plt;0.01)。見(jiàn)表1。

2.3相關(guān)性分析 TLR4與B7-H1 mRNA、蛋白呈正相關(guān)(r=0.785，0.825；P=0.002，0.012)。

表1 B7-H1 mRNA、蛋白表達(dá)結(jié)果

與0 h比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

3 討 論

細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是一種機(jī)體抗腫瘤免疫的形式〔6〕，腫瘤抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和提呈，對(duì)特異性細(xì)胞起到活化作用，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。羅斌等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)缺如某些免疫分子和(或)異常表達(dá)，導(dǎo)致特異性細(xì)胞處于免疫耐受或無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，進(jìn)而避開(kāi)機(jī)體的免疫殺傷作用，這種現(xiàn)象既是免疫逃逸。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和蛋白組學(xué)技術(shù)的研究深入，BC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性蛋白因子逐漸被發(fā)現(xiàn)，包括存活素(survivin)、凋亡抑制蛋白(livin)等〔8，9〕。Rosborough等〔10〕在研究中利用基因沉默(RNAi)技術(shù)，采用載有survivin siRNA的脂質(zhì)體對(duì)原位BC小鼠模型進(jìn)行治療，可發(fā)現(xiàn)在治療的3 w內(nèi)，survivin mRNA的表達(dá)較治療前降低了70%，且腫瘤體積也有所降低，說(shuō)明分子靶向survivin可作為臨床治療BC的新思路。livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新發(fā)現(xiàn)的一員，研究表明轉(zhuǎn)染livin的反義寡核苷酸于BC細(xì)胞中可抑制livin的表達(dá)及細(xì)胞增殖，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶caspase-3，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這些因子雖然被發(fā)現(xiàn)，但是其在BC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制和相互作用尚未完全明確，因此本次研究信號(hào)通路及相關(guān)蛋白表達(dá)，以期為BC的靶向治療提供依據(jù)。

B7家族分子在多種造血干細(xì)胞惡性腫瘤、實(shí)體瘤和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中均表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤中存在共刺激因子B7-H1的高表達(dá)。本研究說(shuō)明脂多糖的確可以活化TLR4信號(hào)通路，增加T24細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)量。且TLR4的影響下B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)升高，TLR4與B7-H1 mRNA及蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。B7-H1是新近發(fā)現(xiàn)的共刺激因子，其與T細(xì)胞、B細(xì)胞表面的PD-1分子結(jié)合，可提供抑制性信號(hào)，抑制兩者的活化和增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)凋亡。Huang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)抑制體外培養(yǎng)的BC T24細(xì)胞系細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、C-Jun N端激酶(ERK、JNK)信號(hào)通路后，TLR4介導(dǎo)的B7-H1表達(dá)上調(diào)作用被削弱，提示絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的活化可能參與了B7-H1相關(guān)的膀胱腫瘤免疫逃逸過(guò)程。另外還有研究證實(shí)B7-H1可誘導(dǎo)Treg表面的Fas/FasL表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)白細(xì)胞介素-10(IL-10)的分泌以誘導(dǎo)活化的細(xì)胞凋亡〔12〕。還有研究〔13〕發(fā)現(xiàn)，自然殺傷(NK)細(xì)胞在B7-H1表達(dá)缺失的情況下仍能增強(qiáng)CTL的殺傷作用，阻斷B7-H1后則可增強(qiáng)鼠結(jié)腸炎性免疫應(yīng)答。

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〔2017-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)22-5528-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.018

江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20161BAB205271)

吳高亮(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿系腫瘤研究。