李丹丹 王 辛 馬 茜 蔣 立 王愛(ài)紅

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222002)

特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠外周血白細(xì)胞介素-1β和干擾素-γ的影響

李丹丹1王 辛1馬 茜1蔣 立1王愛(ài)紅1

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222002)

目的研究特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠外周血白細(xì)胞介素(IL)-1β及干擾素(IFN)-γ的影響。方法將96只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、特制牛肉湯組和肌肽組，每組24只。模型組、特制牛肉湯組和肌肽組采用線栓法制備永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型(pMCAO)，于術(shù)后清醒2 h內(nèi)首次灌胃給藥，特制牛肉湯組予600 mg·kg-1·d-1特制牛肉湯，肌肽組予600 mg·kg-1·d-1肌肽水溶液。假手術(shù)組與模型組予等量無(wú)菌生理鹽水，每日2次，各組大鼠分別于造模后1 d，3 d和7 d處死，各組各時(shí)點(diǎn)8只大鼠。采用Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測(cè)定腦梗死體積分?jǐn)?shù)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)外周血中IL-1β、IFN-γ表達(dá)。結(jié)果腦缺血后，各時(shí)點(diǎn)模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著上升；與模型組相比，予特制牛肉湯7 d后，腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降(Plt;0.05)。腦缺血后，模型組、特制牛肉湯組和肌肽組均可見(jiàn)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)梗死灶。與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽1 d和3 d后，腦梗死體積分?jǐn)?shù)有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，腦梗死體積分?jǐn)?shù)顯著降低(Plt;0.01)。腦缺血后，各時(shí)點(diǎn)模型組大鼠外周血IL-1β水平顯著上升(Plt;0.05)，與模型組相比，予特制牛肉湯7 d后，IL-1β水平明顯下降(Plt;0.05)；予肌肽7 d后，IL-1β有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。腦缺血后3 d和7 d，模型組大鼠外周血IFN-γ水平顯著上升(Plt;0.05)，與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽7 d后，IFN-γ水平明顯下降(Plt;0.01)。結(jié)論特制牛肉湯通過(guò)下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ表達(dá)，從而減輕腦缺血大鼠炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，對(duì)腦起保護(hù)作用。

特制牛肉湯；腦缺血；白細(xì)胞介素-1β；干擾素-γ

炎性損傷在腦缺血后繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用，白細(xì)胞介素(IL)-1β與干擾素(IFN)-γ作為主要促炎介質(zhì)，放大復(fù)雜信號(hào)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，誘導(dǎo)其他傷害性分子〔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6等〕釋放，加重腦缺血損傷〔1,2〕。本課題組前期依據(jù)“藥食同源”理念制備的特制牛肉湯經(jīng)游離氨基酸檢測(cè)，肌肽含量豐富。既往研究表明，肌肽可以通過(guò)抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對(duì)腦起保護(hù)作用〔3〕。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置肌肽水溶液為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察特制牛肉湯和肌肽對(duì)腦缺血后大鼠促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ表達(dá)和腦梗死體積的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠96只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(300±20)g，購(gòu)自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，合格證號(hào)：201500397，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0003。飼養(yǎng)溫度(22±3)℃，光照∶黑暗=12 h∶12 h，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食、飲水，造模前12 h禁食，不禁水。

1.2主要試劑與儀器 肌肽(Sigma公司，美國(guó))；大鼠IL-1β血清檢測(cè)ELISA試劑盒(建成生物公司，南京)；大鼠IFN-γ血清檢測(cè)ELISA試劑盒(Raybiotech公司，美國(guó))；線栓(沙東生物技術(shù)有限公司，北京)；腦切片模具(瑞沃德，深圳)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(亞榮儀器有限公司，上海)；VICTORTMX3多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(PerkinElmer公司，美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1熬制特制牛肉湯 參照前期方法熬制特制牛肉湯〔4〕。購(gòu)精選牛腿肉，去油脂和筋膜后使用電子天平準(zhǔn)確稱重1 kg，切成2 cm3方塊狀碎肉，使用電動(dòng)絞肉機(jī)絞成肉糜狀，放入鍋中慢燉12 h。靜置片刻去浮油，過(guò)濾取上清，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮牛肉湯原液約至60 ml，經(jīng)氨基酸分析儀營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)，特制牛肉湯中肌肽含量約為36.34 mg/ml。

1.3.2動(dòng)物分組及給藥 按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為假手術(shù)組，模型組，特制牛肉湯組和肌肽組，每組再分為1 d，3 d和7 d三個(gè)亞組，每個(gè)亞組各8只。特制牛肉湯劑量的確定以湯中肌肽含量為標(biāo)準(zhǔn)，故特制牛肉湯組給予600 mg·kg-1·d-1特制牛肉湯灌胃，肌肽組給予600 mg·kg-1·d-1肌肽水溶液灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量無(wú)菌生理鹽水灌胃，每組的三個(gè)亞組干預(yù)時(shí)間為1 d、3 d和7 d，每天早晚2次。

1.3.3腦缺血模型制備 參照Longa等〔5〕報(bào)道的方法，采用線栓法復(fù)制大鼠右側(cè)永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(pMCAO)模型：10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，頸部備皮、消毒，取頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎CCA和ECA的近端，用動(dòng)脈夾夾閉ICA后在CCA游離段上剪一小口，并在小口下系一松結(jié)，將制備好的尼龍線栓經(jīng)CCA分支處順I(yè)CA走向緩慢推進(jìn)入顱，線栓標(biāo)記處(18 mm)進(jìn)入CCA與ICA分叉處，系緊小口下松結(jié)。模型成功標(biāo)志：大鼠蘇醒后提尾懸拉出現(xiàn)左上肢蜷縮屈曲，爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或跌倒，若符合上述癥狀但有蛛網(wǎng)膜下腔出血及術(shù)后死亡者，予以剔除并用同一批次大鼠隨機(jī)補(bǔ)足。假手術(shù)組不插入線栓，僅切開(kāi)皮膚分離右側(cè)CCA、ECA和ICA后縫合。

1.3.4神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 參照Bederson五級(jí)四分法在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分:輕微神經(jīng)功能缺損，提尾倒懸時(shí)不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：中度神經(jīng)功能缺損，爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度神經(jīng)功能缺損：身體向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)爬行，意識(shí)水平下降。

1.3.5腦切片TTC染色 術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦，置于-20℃冰箱速凍20 min，去嗅球和低位腦干，自額極后間隔2 mm連續(xù)取冠狀切片5片，并將切片放至2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，避光孵育30 min，為保證染色均勻，每隔15 min翻轉(zhuǎn)一次。待孵育結(jié)束后，將腦切片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。使用Image Pro-Plus6.0(IPP)圖像處理軟件，計(jì)算梗死灶體積和腦片對(duì)側(cè)正常半球的體積，腦梗死體積分?jǐn)?shù)(%)=患側(cè)梗死體積/對(duì)側(cè)半球體積×100%。

1.3.6血清IL-1β和IFN-γ檢測(cè) 術(shù)后1 d、3 d和7 d，各組大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉后，經(jīng)心臟采血，留取血液標(biāo)本，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-1β、IFN-γ含量，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析、LSD法、DunnettT3法、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 各時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分均為0分。與假手術(shù)組比較，腦缺血后1 d、3 d和7 d，模型組均表現(xiàn)出明顯的肢體癱瘓。與模型組相比，予肌肽或特制牛肉湯1 d和3 d未改善神經(jīng)功能缺損癥狀(Pgt;0.05)，予肌肽7 d后，神經(jīng)功能評(píng)分有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，神經(jīng)功能評(píng)分顯著下降(Plt;0.05)，見(jiàn)表1。

2.2特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠腦梗死體積分?jǐn)?shù)的影響 假手術(shù)組未見(jiàn)白色梗死灶，模型組、特制牛肉湯組和肌肽組右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域均可見(jiàn)明顯梗死灶，見(jiàn)圖1。表2可見(jiàn)，與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽1 d及3 d后，腦梗死體積分?jǐn)?shù)有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，腦梗死體積分?jǐn)?shù)顯著下降(Plt;0.01)，予肌肽7d后，腦梗死體積分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。

表1 各組各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較〔M(Q25，Q75)，n=8〕

與模型組比較：1)Plt;0.05

圖1 各組術(shù)后7 d腦組織大體觀察(TTC染色)

組別缺血后1d缺血后3d缺血后7d假手術(shù)組000模型組35.70±20.6649.43±16.7248.20±20.59特制牛肉湯組29.79±22.1532.01±12.5619.85±10.301)肌肽組27.30±20.5140.64±6.3730.58±17.61F值P值0.2500.7821.3430.2914.3910.032

與模型組比較：1)Plt;0.01

2.3特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠外周血IL-1β水平的影響 假手術(shù)組外周血有低水平IL-1β蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血后1 d，外周血IL-1β水平顯著增加，3 d達(dá)到高峰，7 d 略微下降，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。與模型組相比，予肌肽后，各時(shí)點(diǎn)外周血IL-1β表達(dá)均有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯1 d和3 d后，外周血IL-1β表達(dá)雖有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)，予特制牛肉湯7 d后，外周血IL-1β表達(dá)下降顯著(Plt;0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組各時(shí)點(diǎn)腦缺血大鼠外周血IL-1β水平比較

與假手術(shù)組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.05

2.4特制牛肉湯對(duì)腦缺血大鼠外周血IFN-γ水平的影響 假手術(shù)組外周血有低水平IFN-γ蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組各時(shí)點(diǎn)外周血IFN-γ水平迅速上升，但僅腦缺血3 d和7 d后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。與模型組相比，予肌肽組和特制牛肉湯后，各時(shí)點(diǎn)外周血IFN-γ水平有下降趨勢(shì)，但僅在腦缺血7 d后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)，見(jiàn)表4。

表4 各組各時(shí)點(diǎn)腦缺血大鼠外周血IFN-γ水平比較

與假手術(shù)組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.01

2.5腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ的相關(guān)性 腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ均呈正相關(guān)(r=0.946、r=0.867，均Plt;0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ的相關(guān)性

3 討 論

在急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中，均伴有小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的神經(jīng)元壞死，既往研究證實(shí)〔6，7〕，這與炎癥機(jī)制密不可分。該機(jī)制以炎癥細(xì)胞因子、黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子等為要素發(fā)揮腦組織破壞效應(yīng)，其中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ發(fā)揮不可忽視的作用。IL-1β啟動(dòng)IL-1受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激活NF-κB等信號(hào)通路，調(diào)控IL-6、IL-8等促炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，加速神經(jīng)元死亡〔8〕；IFN-γ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞合成IL-1β等促炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)表達(dá)MHC-Ⅱ分子，激發(fā)缺血后免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重腦缺血程度。二者形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，腦組織損傷無(wú)法恢復(fù)〔9〕。因此，調(diào)節(jié)其異常表達(dá)、阻斷缺血后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)減輕腦損傷至關(guān)重要。本研究顯示，腦缺血早期，IL-1β、IFN-γ分泌水平顯著升高，表明永久性腦缺血損傷后，激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ釋放，炎性反應(yīng)失控，這與以往研究結(jié)果一致〔10，11〕。另外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ存在顯著正相關(guān)，提示可以通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)IL-1β和IFN-γ濃度早日識(shí)別、評(píng)估腦梗死病變發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)臨床相關(guān)治療。特制牛肉湯原料為牛肉，牛肉素有“肉中驕子”的美稱，《丹溪心法》曰：牛肉“全重厚和順之性，潤(rùn)枯澤槁”，是以正氣存內(nèi)、邪不可干?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)亦證實(shí)，牛肉富含多種有益成分，如B族維生素、礦物質(zhì)(鐵、鋅)及必需氨基酸等〔12〕。本課題組運(yùn)用氨基酸分析儀檢測(cè)其成分，發(fā)現(xiàn)特制牛肉湯中肌肽含量豐富，這與Guiott等〔13〕研究一致。肌肽是一種結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的生物活性肽，不僅具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和神經(jīng)傳導(dǎo)等生理功能，且可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)，延緩神經(jīng)元凋亡〔14，15〕。本研究顯示，特制牛肉湯組腦保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而制約炎癥反應(yīng)，達(dá)到機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。但特制牛肉湯在抑制炎性因子釋放，改善神經(jīng)功能障礙，減輕腦組織損傷等方面優(yōu)于肌肽。因此推測(cè)除肌肽外，特制牛肉湯中其他成分發(fā)揮協(xié)同抗炎作用，至于哪些成分及具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。目前，肌肽大都采用β-丙氨酸或β-丙氨酸前體和L-組氨酸等原料人工合成，成本高、效率低，且影響脂類的氧化反應(yīng)及其產(chǎn)物檢測(cè)〔16〕。特制牛肉湯制備簡(jiǎn)單，口感、療效均優(yōu)于單一制劑肌肽，可作為輔助食療方應(yīng)用于臨床腦缺血患者飲食治療。

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〔2016-08-25修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R743.3

A

1005-9202(2017)22-5525-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.017

江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目資助項(xiàng)目(No.YSHL0201-26)；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目資助

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)

王愛(ài)紅(1971-)，女，副教授，主要從事心腦血管疾病研究。

李丹丹(1992-)，女，碩士，主要從事心腦血管疾病研究。