霍 雯 鄭 倩 王 濤 高 瑛 許 薇 張成華

(川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠Nrf2表達(dá)調(diào)控及胰島β細(xì)胞功能的影響

霍 雯 鄭 倩 王 濤 高 瑛 許 薇 張成華

(川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

目的研究西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠Nrf2表達(dá)調(diào)控及胰島β細(xì)胞功能的影響。方法雄性Wistar大鼠80只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，采用隨機(jī)數(shù)字表選取20只胰島β細(xì)胞功能指數(shù)作為正常對(duì)照組，其余60只構(gòu)建2型糖尿病模型，造模成功后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為模型組和治療組，每組20只。模型組灌胃0.9%生理鹽水，治療組灌胃0.9%生理鹽水配制的西格列汀，給藥劑量為100 mg·kg-1·d-1，灌胃周期為20 w。對(duì)各組大鼠胰島β細(xì)胞功能，Nrf2表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果干預(yù)20 w后，治療組血糖水平顯著低于模型組(Plt;0.05)，血清胰島素水平顯著高于模型組(Plt;0.05)。治療組(HBCI)、胰島β細(xì)胞分泌功能指數(shù)(FBCI)顯著均高于模型組(Plt;0.05)。治療組大鼠血清和胰腺丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子(TNF)-α顯著低于模型組(Plt;0.05)。治療組大鼠血清和胰腺總超氧化物歧化酶(T-SOD)均顯著高于模型組(Plt;0.05)。治療組大鼠Nrf2表達(dá)水平顯著高于模型組(Plt;0.05)。結(jié)論西格列汀可顯著上調(diào)2型糖尿病大鼠Nrf2表達(dá)水平，改善其胰島β細(xì)胞功能，對(duì)2型糖尿病具有確切的臨床療效。

西格列??；2型糖尿病；Nrf2；胰島β細(xì)胞

糖尿病患者由于長(zhǎng)期受到高糖刺激，使胰島β細(xì)胞功能嚴(yán)重受損。此外，在高血糖刺激下，機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，造成機(jī)體氧化應(yīng)激，而胰島組織的抗氧化能力比機(jī)體其他組織弱，其超氧化物歧化酶(SOD)的量?jī)H為肝臟的30%～40%，谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的含量?jī)H為5%～15%，因此胰島組織受到氧化應(yīng)激損傷的風(fēng)險(xiǎn)更大〔1,2〕。Nrf2/ARE是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路〔3〕。西格列汀治療糖尿病臨床療效確切，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究擬探討西格列汀對(duì)2型糖尿病大鼠Nrf2表達(dá)調(diào)控及胰島β細(xì)胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料 鏈脲佐菌素、戊巴比妥鈉均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，叔丁基對(duì)苯二酚購(gòu)自比利時(shí)Acros公司，胰島素放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(TSOD)、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2動(dòng)物及分組 體重180～200 g的雄性Wistar大鼠80只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，采用隨機(jī)數(shù)字表選取20只大鼠作為對(duì)照組，其余60只大鼠采用高糖高脂飲食喂養(yǎng)4 w，再一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg，注射72 h后檢測(cè)血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L為造模成功。之后將造模成功的大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為模型組和西格列汀治療組，每組20只。模型組灌胃0.9%生理鹽水，治療組于每日早上9：00～10：00灌胃0.9%生理鹽水配制的西格列汀，給藥劑量為100 mg·kg-1·d-1，灌胃周期為20 w。

1.3標(biāo)本采集 各組大鼠標(biāo)本采集前禁食12 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g進(jìn)行腹腔注射，麻醉完成后，將大鼠四肢朝上固定，消毒后打開腹腔、暴露腹部。分離腹主動(dòng)脈，用采血針斜面向上刺向近心端，抽取約5 ml至肝素抗凝管，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，分離上清-80℃凍存?zhèn)溆?。找到胰腺迅速分離并摘取，注意無菌，冰生理鹽水沖洗后用無菌紗布吸干，放入液氮罐速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4觀察指標(biāo)及方法 (1)血糖及血清胰島素測(cè)定：分別在適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w、造模后及干預(yù)20 w后采用血糖檢測(cè)儀檢測(cè)各組大鼠空腹血糖(FPG)，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清胰島素水平，同時(shí)評(píng)估各組大鼠胰島β細(xì)胞功能，胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HBCI)=20×Fins/(FPG-3.5)；胰島β細(xì)胞分泌功能指數(shù)(FBCI)=Fins/FPG。(2)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：在西格列汀干預(yù)結(jié)束后分別采集各組大鼠血清和胰腺，分別測(cè)定MDA、TNF-α和T-SOD水平。(3)Nrf2表達(dá)水平的測(cè)定：干預(yù)20 w后，采集各組大鼠胰尾組織100 mg，進(jìn)行蛋白提取、定量，取等量蛋白用于10%SDS-PAGE，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉，加入一抗溶液兔抗大鼠Nrf2(1∶800)，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參兔抗大鼠GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜后加入相應(yīng)的二抗溶液，室溫孵育1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，再進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)成像，測(cè)定灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖、血清胰島素水平比較 1 w時(shí)，各組大鼠血糖、血清胰島素水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)。造模后，對(duì)照組大鼠血糖水平顯著低于模型組(Plt;0.05)和治療組(Plt;0.05)，血清胰島素水平顯著高于模型組(Plt;0.05)和治療組(Plt;0.05)。干預(yù)20 w后，治療組血糖水平顯著低于模型組(Plt;0.05)，血清胰島素水平顯著高于模型組(Plt;0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 各組大鼠血糖、血清胰島素水平

與對(duì)照組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.05；下表同

2.2各組大鼠胰島β細(xì)胞功能相關(guān)指數(shù)比較 1 w時(shí)，各組大鼠HBCI、FBCI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；造模后，對(duì)照組大鼠HBCI、FBCI顯著均顯著高于模型組(Plt;0.05)和治療組(Plt;0.05)；干預(yù)20 w后，治療組HBCI、FBCI顯著均高于模型組(Plt;0.05)，見表2。

2.3各組大鼠干預(yù)20 w后血清和胰腺丙二醛(MDA)，腫瘤壞死因子(TNF)-α和T-SOD水平 對(duì)照組大鼠血清和胰腺M(fèi)DA、TNF-α均顯著低于模型組和治療組，治療組大鼠血清和胰腺M(fèi)DA、TNF-α顯著低于模型組(Plt;0.05)；對(duì)照組大鼠血清和胰腺T-SOD均顯著高于模型組和治療組，治療組大鼠血清和胰腺T-SOD均顯著高于模型組，見表3。

2.4干預(yù)20 w后各組大鼠Nrf 2表達(dá)水平分析 對(duì)照組大鼠Nrf2表達(dá)水平顯著高于模型組(Plt;0.05)；治療組大鼠Nrf2表達(dá)水平顯著高于模型組(Plt;0.05)，見圖1。

表2 各組大鼠胰島β細(xì)胞功能比較

表3 各組大鼠干預(yù)20 w后血清和胰腺M(fèi)DA，TNF-α和T-SOD水平比較

圖1 各組大鼠Nrf2表達(dá)水平

3 討 論

糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖刺激，引起機(jī)體長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而影響胰腺分泌胰島素的功能，造成病情加重，因此在糖尿病臨床治療中對(duì)胰島β細(xì)胞功能的評(píng)估很重要〔4,5〕。此外，有研究表明，通過抗氧化劑清除高糖作用引起的胰島β細(xì)胞內(nèi)升高ROS能夠促進(jìn)其胰島素分泌功能的恢復(fù)，而Nrf2是目前已經(jīng)證實(shí)的與細(xì)胞抗氧化能力密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子〔6〕。

本研究所采用的造模方法成功構(gòu)建了2型糖尿病大鼠模型，為此后的藥物干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。證實(shí)了西格列汀對(duì)2型糖尿病具有確切療效，同時(shí)能夠顯著改善胰島β細(xì)胞功能。

MDA是反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)，TNF-α是胰島β細(xì)胞慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵的炎癥因子，而SOD是Nrf2的一個(gè)下游靶基因，具有較強(qiáng)的清除自由基和炎癥因子的作用〔7～9〕。本研究結(jié)果表明西格列汀能夠增加SOD水平，從而清除2型糖尿病大鼠體內(nèi)的炎癥因子和氧自由基，從而緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激程度和炎癥，進(jìn)而改善病情。西格列汀能夠顯著提高2型糖尿病大鼠體內(nèi)Nrf2的表達(dá)水平，通過相關(guān)通路刺激使SOD水平升高，進(jìn)而清除氧自由基、炎癥因子。Nrf2能夠保護(hù)胰島β細(xì)胞免受氧化反應(yīng)的損傷，減少細(xì)胞死亡，從而使氧化應(yīng)激相關(guān)的胰島素分泌減少得到緩解，有助于病情的改善。

綜上，西格列汀可顯著上調(diào)2型糖尿病大鼠Nrf2表達(dá)水平，改善其胰島β細(xì)胞功能，對(duì)2型糖尿病具有確切的臨床療效。

1Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(5):816-23.

2胡亞飛,蘇文進(jìn),賈文波,等.糖尿病前期和2型糖尿病患者體內(nèi)氧化抗氧化狀態(tài)研究〔J〕.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2007;52(3):232-4,238.

3張 靖,譚親友.Nrf2-ARE信號(hào)通路功能與臨床疾病及相關(guān)藥物的研究新進(jìn)展〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2016;36(15):1-6.

4王 堯,黃 歡,王艷萍,等.糖尿病患者血糖波動(dòng)與氧化應(yīng)激狀態(tài)的相關(guān)性研究〔J〕.中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2011;14(23):2606-8.

5周 玉,王伶俐,黃 楊,等.糖尿病大鼠的SOD活性與抗氧化劑治療對(duì)機(jī)體抗氧化狀態(tài)的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2016;24(4):422-6.

6廖 霞,鄭少杰,盧可可,等.植物多酚通過Nrf2/ARE信號(hào)通路抗氧化作用研究進(jìn)展〔J〕.食品科學(xué),2016;37(7):227-32.

7Lee YS,Cheon IS,Kim BH,etal.Loss of extracellular superoxide dismutase induces severe IL-23 mediated skin inflammation in mice〔J〕.J Invest Dermatol,2013;133(3):732-41.

8Li C,Zhou HM.The role of manaese superoxide dismutase in inflammation defense〔J〕.Enzyme Res,2011;112:387176.

9Mansuroglu B,Derman S,Yaba A,etal.Protective effect of chemically modified SOD on lipid peroxidation and antioxidant status in diabetic rats〔J〕.Int J Biol Macromol,2015;72(1):79-87.

〔2017-02-20修回〕

(編輯 李相軍)

EffectofsitagliptinonpancreaticbetacellfunctionandtheexpressionofNrf2intype2diabeticrats

HUOWen,ZHENGQian,WANGTao,etal.

NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China

ObjectiveTo study the effect of sitagliptin on pancreatic beta cell function and the expression of Nrf2 in type 2 diabetic rats.Methods80 male Wistar rats were fed for 1 week, as 20 rats were selected as normal control group according to the random number table, then construct the model of type 2 diabetes mellitus. The remaining 60 rats were randomly divided into model and treatment groups, 20 rats in each group. After the success of modeling, the model group was orally administered with 0.9% saline, and the treatment group was given sitagliptin dissolved with 0.9% saline.ResultsAfter 20 weeks of treatment, the blood glucose level of treatment group was significantly lower than that of model group (Plt; 0.05), serum insulin level was significantly higher than that of model group (Plt;0.05). The levels of HBCI, FBCI in treatment group were significantly higher than those in model group (Plt;0.05). The levels of serum MDA, TNF- alpha and MDA in pancreatic of treatment group were significantly lower than those in model group (Plt;0.05).The levels of T-SOD in serum and pancreas in treatment group were significantly higher than those in model group. The expression level of Nrf2 of treatment group was significantly higher than that of model group (Plt;0.05).ConclusionsSitagliptin could upregulate Nrf2 expression in type 2 diabetic rats, improve the function of islet beta cells, which has definite clinical effect on type 2 diabetes.

Sitagliptin; Type 2 diabetes; Nrf2; Pancreatic beta cell function

R587

A

1005-9202(2017)22-5503-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(青年科學(xué)基金)項(xiàng)目(No.21503026)

張成華(1985-)，男，博士，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及教學(xué)研究。

霍 雯(1988-)，女，碩士，主要從事機(jī)能實(shí)驗(yàn)學(xué)和糖尿病發(fā)病機(jī)制和治療研究。