李 響 劉宏偉 梁 杰 吳志遠 張培華 吳志賢

(暨南大學附屬第一醫(yī)院整形科，廣東 廣州 510630)

異澤蘭黃素抑制瘢痕組織成纖維細胞增殖的機制

李 響1劉宏偉 梁 杰1吳志遠1張培華1吳志賢1

(暨南大學附屬第一醫(yī)院整形科，廣東 廣州 510630)

目的探討異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞增殖的影響及機制。方法應(yīng)用MTT 法檢測異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞活力的影響，流式細胞儀檢測異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞中活性氧(ROS)的生成及細胞凋亡的影響，Western印跡法檢測異澤蘭黃素對細胞內(nèi)JNK和Bcl2磷酸化的影響。結(jié)果2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml異澤蘭黃素作用細胞24 h后，細胞活力呈濃度依賴性降低。ROS抑制劑(NAC)預處理細胞1 h能顯著抑制異澤蘭黃素對細胞活力的抑制作用。10.0 μg/ml異澤蘭黃素作用細胞24 h能促進細胞ROS生成和細胞凋亡，細胞凋亡率為(47.20±1.60)%，與正常對照組相比具有顯著統(tǒng)計學差異；促進JNK磷酸化水平和Bcl2表達水平，JNK磷酸化水平為(3.12±0.25)倍，Bcl2磷酸化水平為(2.84±0.22)倍，與正常對照組相比具有顯著性差異。JNK磷酸化抑制劑和NAC均能顯著抑制異澤蘭黃素誘導的細胞凋亡和JNK的磷酸化。結(jié)論異澤蘭黃素可誘導瘢痕組織成纖維細胞ROS的產(chǎn)生，通過激活JNK/Bcl2通路誘導細胞凋亡，從而抑制成千維細胞的增殖活性。

異澤蘭黃素；瘢痕成纖維細胞；活性氧；細胞凋亡；JNK通路

作為一種病理性瘢痕，瘢痕疙瘩因其浸潤性生長的特性，治療后極易復發(fā)。因此，對于該病如何預防和有效治療，一直是亟待整形外科界解決的問題〔1〕。成纖維細胞是瘢痕疙瘩形成與增生的效應(yīng)細胞，瘢痕疙瘩組織學表現(xiàn)為成纖維細胞大量增生〔2〕。中醫(yī)藥對病理性瘢痕的防治有著悠久的歷史，具有較好療效。異澤蘭黃素(Eupatilin)分子式為C18H16O7，屬于O-甲基黃酮，是中藥艾葉里面發(fā)現(xiàn)的一種重要的黃酮類活性成分〔3〕，有研究表明，異澤蘭黃素對胃癌有明顯的治療作用，能夠通過下調(diào)核因子(NF)-κB活性抑制人胃癌細胞的侵襲和增殖能力〔4〕。本研究探討異澤蘭黃素促凋亡作用與活性氧(ROS)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的關(guān)系，進一步闡明其抑制瘢痕成纖維細胞生長的作用及分子機制，為異澤蘭黃素治療瘢痕疙瘩提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1細胞株 瘢痕疙瘩臨床標本7例，男4例，女3例，年齡(40.7±3.5)歲。來源于廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院整形外科門診及住院手術(shù)患者。在行手術(shù)切除前，所有患者均未經(jīng)過其他治療且無其他的全身器質(zhì)性病變。所有標本均根據(jù)臨床和病理(HE染色切片的組織學檢查) 診斷證實。標本都經(jīng)廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的論證、許可，且均取得患者的知情與同意。采用手術(shù)切除的方法獲得正常皮膚或者瘢痕疙瘩組織，運用組織塊培養(yǎng)法對其原代培養(yǎng)，整個過程中均需無菌操作。當成纖維細胞長出且融合成片時開始傳代，選取傳至3～8代的成纖維細胞進行實驗。

1.2藥品、試劑和儀器 異澤蘭黃素購于美國Sigma，薄層色譜法(TLC)檢測藥物的純度≥98%，CAS：22368-21-4；用PBS溶解制得10 mg/ml的異澤蘭黃素溶液，培養(yǎng)液稀釋得到2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml濃度的溶液。曲安奈德 (Triamcinolone acetonide) 購于美國Sigma，TLC檢測藥物純度≥99%，CAS：76-25-5；采用DMSO配制得50 mg/ml的曲安奈德溶液待用。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；JNK、p-JNK、Bcl2抗體(美國CST公司)；HRP標記羊抗兔IgG、DCFH-DA ROS檢測試劑盒、ROS抑制劑N-acetyl-l-cysteine(NAC，中國碧云天生物技術(shù))；p-JNK抑制劑SP600125(美國Selleck公司)。流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國BD)；多功能酶標儀、多功能凝膠成像系統(tǒng)(VersaDoc MP5000，美國Bio-Rad)。

1.3方法

1.3.1細胞的培養(yǎng) 將原代分離的人瘢痕成纖維細胞單層接種在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，常規(guī)換液；在細胞密度匯合至90%～95%時，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2MTT法檢測異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的瘢痕成纖維細胞，0.25%胰酶消化離心，將細胞濃度調(diào)整為2.5×104個/ml，均以100 μl/孔種植于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入不同終濃度(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml)的異澤蘭黃素；或加入終濃度為5.0 mmol/L的NAC培養(yǎng)1 h后再加入不同終濃度的異澤蘭黃素。每組設(shè)置6 個復孔，同時設(shè)置陰性對照(PBS處理)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5.0 mg/ml MTT 10 μl再培養(yǎng)3 h，棄上清液，每孔加入 150 μl DMSO溶解，于酶標儀490 nm下測定各孔吸光值(A490)。

1.3.3異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞內(nèi)ROS的影響 取對數(shù)生長期的瘢痕成纖維細胞，0.25%胰酶消化離心，調(diào)整細胞濃度為2.5×104個/孔種植于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入終濃度為40.0 μg/ml的異澤蘭黃素(MTT實驗結(jié)果表明40.0 μg/ml的異澤蘭黃素能顯著抑制細胞活力，因此選用其為以下研究的濃度)，或分別加入終濃度為5.0 mmol/L的NAC和10.0 μmol/L p-JNK抑制SP600125培養(yǎng)1 h后再加入終濃度為40.0 μg/ml異澤蘭黃素培養(yǎng)24 h。取處理后的細胞，0.25%胰酶消化離心收集細胞，PBS漂洗2次后，加入終濃度為5.0 μmol/L的DCFH-DA染色液，37℃作用30 min，PBS漂洗2次，用流式細胞儀測定細胞內(nèi)二氯熒光素的平均熒光強度，從而分析異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞內(nèi)ROS水平的影響。

1.3.4流式細胞儀檢測異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞凋亡的影響 通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞凋亡的影響。細胞接種及給藥處理同“1.3.2”，按照試劑盒的操作說明書，通過1×Annexin Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl稀釋的Annexin V-FITC在冰上孵育30 min，再用5 μl稀釋的PI對細胞進行復染，冰上孵育5 min后立即用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5Western印跡檢測JNK信號通路蛋白表達 細胞接種及給藥處理同“1.3.2”，PBS洗滌后加入100 μl的細胞裂解液RIPA裂解細胞，10 000 r/min離心15 min，取上清即為蛋白樣品。采用BCA蛋白測定試劑盒對上清液的總蛋白進行蛋白定量，從每個樣品中取總蛋白30 μg加入電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，在電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶300稀釋的Ⅰ抗，4℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜5 min×3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標記的Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜6次，每次5 min，加入ECL化學發(fā)光液進行顯色，用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，運用ImageJ2x軟件進行灰度值分析。

1.4統(tǒng)計學處理 實驗至少重復3次,采用SPSS20.0 軟件，多組間比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞增殖的影響 異澤蘭黃素可劑量依賴性地抑制瘢痕成纖維細胞增殖。MTT結(jié)果顯示，異澤蘭黃素處理組與對照組相比有顯著性差異(Plt;0.01)。2.5～40.0 μg/ml異澤蘭黃素處理24 h對瘢痕成纖維細胞增殖具有不同程度的抑制作用，其IC50為10.65 μg/ml，用10 μg/ml的濃度進行后續(xù)細胞實驗。加入5.0 mmol/L NAC后，濃度低于20.0 μg/ml的異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞增殖的抑制率明顯降低。見表1。

表1 異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞增殖率的影響

與對照組比較：1)Plt;0.01；與預處理組比較：2)Plt;0.05

2.2異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞ROS產(chǎn)生的影響 ROS表達量表異澤蘭黃素處理組(3 750±26)與對照組(1 781±4)間有顯著差異(Plt;0.01)。10.0 μg/ml異澤蘭黃素作用于瘢痕成纖維細胞24 h能顯著誘導細胞內(nèi)ROS的生成，NAC能顯著抑制異澤蘭黃素誘導ROS的生成(1 840±18)，SP600125對異澤蘭黃素誘導的ROS(3 708±22)沒有明顯的影響，表明異澤蘭黃素并不是通過JNK磷酸化誘導ROS的產(chǎn)生。曲安奈德組ROS水平為1 750±8。

2.3異澤蘭黃素對瘢痕組織成纖維細胞凋亡的影響 異澤蘭黃素處理組凋亡率〔(47.2±1.6)%〕與對照組〔(7.9±0.8)%〕相比具有顯著差異(Plt;0.01)。10.0 μg/ml異澤蘭黃素處理24 h誘導的細胞凋亡率顯著增加，加入活性氧抑制劑NAC〔(9.6±0.9)%〕和p-JNK抑制劑SP600125〔(12.8±1.1)%〕均能顯著抑制異澤蘭黃素誘導的瘢痕成纖維細胞凋亡(Plt;0.01)，表明異澤蘭黃素誘導瘢痕成纖維細胞凋亡與ROS和JNK的磷酸化相關(guān)。曲安奈德組凋亡率為〔(36.1±1.2)%〕。

2.4異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞JNK/Bcl2磷酸化的影響 免疫印跡檢測結(jié)果表明，10.0 μg/ml異澤蘭黃素能顯著增強p-JNK和Bcl2的磷酸化水平，ROS抑制劑NAC能顯著抑制異澤蘭黃素誘導p-JNK和Bcl2的磷酸化增加，表明異澤蘭黃素誘導瘢痕成纖維細胞ROS的生成、促進JNK的磷酸化，從而激活JNK/Bcl2通路，促進Bcl2表達，誘導細胞凋亡。見圖1，表2。

圖1 異澤蘭黃素對瘢痕成纖維細胞JNK、p-JNK及Bcl2蛋白表達的影響

組別Bcl2JNKp-JNK/JNK對照組1.001.001.00異澤蘭黃素組3.12±0.251.06±0.312.84±0.221)NAC組0.89±0.151.03±0.170.87±0.052)SP600125組0.95±0.111.06±0.150.92±0.062)曲安奈德組1.15±0.581.08±0.151.06±0.42

與對照組比較：1)Plt;0.01；與異澤蘭黃素組比較：2)Plt;0.01

3 討 論

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷后引發(fā)的以成纖維細胞異常增殖并分泌大量細胞外基質(zhì)為主要特征的皮膚纖維化疾病，治療效果不佳，復發(fā)率較高，發(fā)病機制尚不清楚〔5〕。瘢痕疙瘩雖是一種良性皮膚腫瘤，但無自愈傾向，瘢痕疙瘩往往不斷侵蝕周圍正常皮膚，經(jīng)久不愈、反復感染者有癌變傾向〔6〕。因此，闡明瘢痕疙瘩的分子發(fā)病機制，針對其發(fā)病的特異性環(huán)節(jié)研究和開發(fā)治療瘢痕疙瘩的新藥已成為迫切需要。在瘢痕疙瘩中，成纖維細胞的密度普遍增高，其異常的增殖、分化、凋亡都直接造成了瘢痕疙瘩的生成〔7〕。故而，在瘢痕疙瘩的發(fā)生機制研究中，針對瘢痕成纖維細胞作用的研究最廣泛亦最清晰。

本研究通過MTT檢測結(jié)果表明，異澤蘭黃素能誘導瘢痕成纖維細胞ROS生成和細胞凋亡，提示異澤蘭黃素可能通過誘導瘢痕成纖維細胞ROS生成而產(chǎn)生促凋亡作用。

ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的分子，一直以來被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素〔8〕。隨著自由基生物學研究的發(fā)展，研究者們逐漸認識到ROS 可雙向調(diào)控某些腫瘤細胞的凋亡和增殖，并發(fā)現(xiàn)了自由基與細胞信號轉(zhuǎn)導之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。腫瘤細胞自身能夠誘導氧化應(yīng)激，其內(nèi)部的 ROS 水平高于正常細胞，對于ROS的敏感度也高于正常細胞，同時腫瘤細胞中SOD、GPx等抗氧化酶的含量低于正常細胞。鑒于腫瘤細胞內(nèi)高濃度的ROS以及抗氧化損傷防御系統(tǒng)的缺陷等因素，在同等濃度ROS的作用下，腫瘤細胞較正常細胞而言腫瘤細胞更先發(fā)生凋亡〔9〕。大量研究表明，ROS可通過促進腫瘤細胞凋亡、導致腫瘤細胞壞死和參與自噬性細胞死亡等方面發(fā)揮抑瘤作用〔10〕。本研究表明異澤蘭黃素能夠誘導瘢痕成纖維細胞ROS的生成，通過ROS清除劑NAC清除了異澤蘭黃素誘導的ROS之后，異澤蘭黃素誘導的細胞凋亡被抑制，表明ROS在異澤蘭黃素誘導的細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。

JNK是促分裂原活化蛋白激酶MAPK家族重要成員之一，可以調(diào)控細胞內(nèi)外不同的應(yīng)激反應(yīng)〔11〕。近年來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)JNK信號通路能介導多種細胞外刺激誘導的細胞凋亡，在調(diào)控細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，JNK信號通路介導的細胞凋亡參與了人類多種疾病發(fā)生發(fā)展的過程〔12～14〕。JNK磷酸化不僅能夠活化p53依賴的細胞凋亡，而且能夠調(diào)整Bcl2家族蛋白，使Bcl2促凋亡蛋白活化，抑制抗凋亡蛋白活性，從而介導細胞凋亡的發(fā)生〔15〕。大量研究表明，ROS作為第二信使參與JNK信號通路的活化。ROS可通過調(diào)節(jié)ASK1、Src和MLK3等途徑激活JNK通路〔11,16～18〕。ROS/JNK信號通路是哺乳動物細胞中誘發(fā)細胞凋亡的一條重要途徑。本研究中異澤蘭黃素處理瘢痕成纖維細胞后，磷酸化JNK和Bcl2的表達水平明顯增加，表明異澤蘭黃素能夠激活JNK/Bcl2通路，而加入JNK磷酸化抑制劑SP600125后，異澤蘭黃素誘導的細胞凋亡被抑制，證明異澤蘭黃素通過激活JNK/Bcl2通路而誘導瘢痕成纖維細胞凋亡。加入NAC后，異澤蘭黃素誘導的JNK磷酸化水平明顯降低，表明在此過程中，異澤蘭黃素通過ROS/JNK/Bcl2通路誘導細胞凋亡。

總之，本研究表明異澤蘭黃素通過誘導ROS的產(chǎn)生，促進了JNK磷酸化從而激活JNK/Bcl2信號通路，繼而誘導瘢痕成纖維細胞凋亡，抑制了瘢痕成纖維細胞的生長。闡明了異澤蘭黃素抑制人瘢痕組織成纖維細胞生長的作用機制，將有可能為異澤蘭黃素應(yīng)用于臨床瘢痕疙瘩的治療提供理論基礎(chǔ)。

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〔2017-02-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R364

A

1005-9202(2017)22-5495-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.005

國家自然科學基金資助項目(81372065)

1 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院整形外科

劉宏偉(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士，主要從事自體脂肪移植，面部年輕化研究。

李 響(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事瘢痕、脂肪移植等研究。