唐文軍 閆其星 王天柱 易國輝 薛麗 林海鋒

TP63 rs6790167多態(tài)性與海南漢族人肺癌的相關(guān)性研究

唐文軍①閆其星②王天柱③易國輝④薛麗④林海鋒③

目的：探討TP63 rs6790167多態(tài)性與海南漢族人肺癌之間的相關(guān)性。方法收集2014年6月至2015年7月258例海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的肺癌患者和270例健康對照者的外周靜脈血，采用病例對照研究的方法，提取血液基因組DNA，應(yīng)用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（allele-specific PCR，AS-PCR）法檢測肺癌組和對照組人群的TP63 rs6790167位點(diǎn)的多態(tài)基因型。結(jié)果肺癌組中TP63 rs6790167位點(diǎn)的G等位基因分布頻率明顯高于對照組（P=0.045）。進(jìn)一步分層分析顯示，在肺腺癌組中，非吸煙男性的GG基因型分布和G等位基因的分布頻率均顯著高于對照組（P＜0.001，P=0.001），攜帶GG基因型的非吸煙男性的肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與AA基因型相比明顯升高（OR=6.66，95%CI為2.16～20.41），相對于TP63 rs6790167位點(diǎn)的A等位基因，攜帶G等位基因的非吸煙男性的肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（OR=2.54，95%CI為1.42～4.56）。結(jié)論：TP63 rs6790167多態(tài)性與肺腺癌的發(fā)生有關(guān)，對非吸煙男性人群肺腺癌的發(fā)生可能具有預(yù)測作用。

TP63 肺癌 單核苷酸多態(tài)性 易感性 海南

肺癌是目前臨床上最常見惡性腫瘤，也是死亡率最高的癌癥之一。2012年我國肺癌新發(fā)病例約65.3萬，致死人數(shù)約59.7萬，分別占惡性腫瘤總數(shù)的21.3%和腫瘤死亡總數(shù)的27.1%，發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤之首［1］。除吸煙和環(huán)境污染外，遺傳因素己被公認(rèn)為是肺癌發(fā)生的重要原因之一。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是人類可遺傳的變異中最常見的一種，是影響多基因疾病易感性的關(guān)鍵因素，現(xiàn)已成為研究肺癌分子標(biāo)記物的重要內(nèi)容和篩選肺癌高危人群的重要手段。

TP63基因是抑癌基因TP53家族成員之一，位于3q28，與TP53有高度的序列和結(jié)構(gòu)同源性。其編碼的TP63蛋白擁有TAp63、ΔNp63等多個(gè)亞型，生物學(xué)功能較TP53更具多樣性。其中TAp63可與TP53的DNA結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，活化TP53靶基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和觸發(fā)細(xì)胞凋亡［2-3］。而ΔNp63可通過競爭性結(jié)合TAp63的結(jié)合位點(diǎn)，抑制TAp63和TP53促細(xì)胞凋亡的功能而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［4］。TP63在肺癌中呈高水平表達(dá)，且更多地顯示出ΔNp63促癌特性而非TAp63抑癌功能［5］。

TP63 rs6790167位于TP63基因9號內(nèi)含子，目前其功能尚不完全清楚，可能在TP63基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上具有重要作用，并影響ΔNp63的表達(dá)。近期國外有研究顯示，該位點(diǎn)的基因多態(tài)性與肺癌的易感性密切相關(guān)［6］。因此，本研究選擇TP63 rs6790167作為研究對象，探討其與海南漢族人肺癌易感性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本研究共納入258例肺癌患者和270例健康對照者。病例組選擇2014年6月至2015年7月就診海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院并經(jīng)病理確診為肺癌的新發(fā)病例。對照組為同時(shí)期入院體檢的健康人群，與病例組性別比例一致，年齡（±5歲）與病例頻數(shù)匹配。所有研究對象均為無親緣關(guān)系的海南漢族人群。

肺癌組人群納入標(biāo)準(zhǔn)：1）病理組織學(xué)確診為原發(fā)性肺癌；2）為單一肺癌，無合并其他腫瘤；3）無明確職業(yè)性致癌因素接觸史；4）未經(jīng)化療和放療。對照人群為同時(shí)期在本院體檢中心接受常規(guī)健康體檢人群，納入標(biāo)準(zhǔn)為1）體檢結(jié)果報(bào)告為健康；2）無肺部惡性腫瘤家族史；3）無明確職業(yè)性致癌因素接觸史；4）年齡、性別與肺癌人群匹配。

所有研究對象均被抽取3 mL空腹外周靜脈血，3% EDTA溶液抗凝。將吸煙者定義為吸煙支數(shù)≥1支/天，且持續(xù)半年以上，否則定義為非吸煙者；所有患者均進(jìn)行CEA、NSE、SCC、CA199、CA125、CA153等腫瘤標(biāo)志物檢測，異常定義為其中有一項(xiàng)高于正常參考值者。本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過，所有研究對象對本研究均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過Gene Quest軟件設(shè)計(jì)AS-PCR引物（正向引物F：5′-CCAGCGTTTCGTCAGAAC-3′；反向引物R：5′-TC TCTAGCCCTCTCCACTATATG-3′；反向等位基因特異性引物RA：5′-CCTTTCCCATTGTCACAGATGAT-3′；正向等位基因特異性引物FG：5′-TTTTACAGTATGATCAT CATCTCG-3′），由上海生工生物技術(shù)公司合成引物。使用血液基因組DNA提取試劑盒從EDTA抗凝的靜脈全血中提取基因組DNA。分別采用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的含量及純度。采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（allele-specific PCR，AS-PCR）法進(jìn)行TP63 rs6790167位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測。具體如下：反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括2×TaqMan Master 10 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、Primer RA/FG 1 μL、基因組DNA 2 μL（50 ng），ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，變性95℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，并比較PCR產(chǎn)物與Marker的條帶，判定擴(kuò)增片段長度，鑒定PCR產(chǎn)物。盲法抽取不低于10%的樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPASS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)變量比較釆用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；以比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對危險(xiǎn)度；采用Logistic回歸分析方法分析TP63 rs6790167多態(tài)性與肺癌相關(guān)性的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般資料

病例組中吸煙吸煙者136例（54.0%），顯著高于對照組89例（33.0%）。病例組中有腫瘤家族史的患者占10.5%，高于對照組的7.9%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 肺癌組與對照組人群的TP63 rs6790167多態(tài)性分析

對照組和病例組的TP63 rs6790167位點(diǎn)的各基因型分布頻率符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律（χ2=2.86，P=0.091）。TP63 rs6790167位點(diǎn)的等位基因分布頻率顯示，病例組中G等位基因分布頻率明顯高于對照組（P=0.045，表2）。

2.3 TP63 rs6790167多態(tài)性與肺癌相關(guān)性分析

為明確TP63 rs6790167多態(tài)性與肺癌的相關(guān)性，采用多元回歸分析的方法處理數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示肺癌的發(fā)生與吸煙（P＜0.001）、性別（P=0.015）和TP63 rs6790167多態(tài)性（P=0.032）相關(guān)。病理類型主要為腺癌、鱗癌和小細(xì)胞肺癌，因此本研究主要分析這3種病理類型肺癌的基因型和等位基因的分布特點(diǎn)。

2.4 按性別和吸煙狀態(tài)分層分析小細(xì)胞肺癌患者的TP63 rs6790167的多態(tài)性

由于入組的吸煙女性人數(shù)極少，僅對非吸煙的女性肺癌患者各病理類型TP63 rs6790167的基因型分布和等位基因分布頻率在各病例組與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05，表3）。

2.5 按性別和吸煙狀態(tài)分層分析肺腺癌患者的TP63 rs6790167的多態(tài)性

腺癌患者的TP63 rs6790167的基因型分布和等位基因分布頻率在各組分布情況見表4。在非吸煙男性組中，GG基因型分布和G等位基因的分布頻率均顯著高于對照組（P＜0.001，P=0.001），攜帶GG基因型的非吸煙男性肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與TT基因型相比明顯升高（OR=6.66，95%CI為2.16～20.41），相對于T等位基因，攜帶C等位基因的非吸煙男性的肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加（OR=2.54，95%CI為1.42～4.56）。

表1 病例組和對照組人群的一般資料Table 1 General information of patients with lung cancer and healthy controls

表2 病例組和對照組人群TP63 rs6790167位點(diǎn)的多態(tài)性分布Table 2 Genotype frequencies of TP63 rs6790167 in patients and controls

2.6 按性別和吸煙狀態(tài)分層分析肺鱗癌患者的TP63 rs6790167的多態(tài)性

肺鱗癌患者的TP63 rs6790167的基因型分布和等位基因分布頻率在各組分布情況見表5。各基因型分布和等位基因的分布頻率在各病例組與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.7 TP63 rs6790167多態(tài)性與臨床指標(biāo)的關(guān)系

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已證實(shí)TP63 rs6790167基因多態(tài)性與非吸煙男性肺腺癌患者密切相關(guān)，為明確其與非吸煙男性肺腺癌患者各臨床指標(biāo)的關(guān)系，依據(jù)其臨床指標(biāo)特征分為兩組（表6），比較TP63 rs6790167的基因型分布和等位基因的分布頻率，結(jié)果提示各組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 不同性別和吸煙狀態(tài)小細(xì)胞肺癌的TP63 rs6790167位點(diǎn)多態(tài)性分布Table 3 Genotype frequencies of TP63 rs6790167 in SCLC and controls with different smoking status and gender

表4 不同性別和吸煙狀態(tài)肺腺癌的TP63 rs6790167位點(diǎn)多態(tài)性分布Table 4 Genotype frequencies of TP63 rs6790167 in AD and controls with different smoking status and gender

表5 不同性別和吸煙狀態(tài)肺鱗癌的TP63 rs6790167位點(diǎn)多態(tài)性分布Table 5 Genotype frequencies of TP63 rs6790167 in SCC and controls with different smoking status and gender

表6 非吸煙男性肺腺癌中TP63 rs6790167多態(tài)性與臨床指標(biāo)的關(guān)系Table 6 Association of TP63 rs6790167 polymorphisms with clinical characteristics in non-smoking fernale adenocarcinoma patients patients

3 討論

本研究通過病例對照研究分析了TP63 rs6790167多態(tài)性與海南漢族人群肺癌易感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肺癌患者TP63 rs6790167 G等位基因的分布頻率高于對照組，提示G等位基因可能與肺癌的發(fā)生相關(guān)。按性別和吸煙狀態(tài)進(jìn)一步的分層分析顯示，在肺腺癌組的非吸煙男性的GG基因型或G等位基因的分布頻率均高于對照組，提示G等位基因可能與非吸煙男性的肺腺癌發(fā)病相關(guān)。

rs6790167位于TP63基因的3’端，該區(qū)域可調(diào)控ΔNp63表達(dá)水平［7］。因此，rs6790167可能在TP63基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上可能具有重要作用。有研究認(rèn)為，該區(qū)域的T等位基因可降低TP63的轉(zhuǎn)錄后水平，影響ΔNp63的表達(dá)，降低惡性腫瘤的發(fā)生［8］。目前，有關(guān)TP63基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系已被多項(xiàng)研究證實(shí)［9-12］。一個(gè)共納入93 751例患者的Meta分析研究顯示，TP63 rs10937405的 G等位基因和rs4488809的G等位基因是肺腺癌的發(fā)生的高?；颍?3］。Pathak等［6］報(bào)道TP63 rs6790167基因多態(tài)性是美國黑人女性非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本課題組針對該位點(diǎn)的前期研究顯示，TP63 rs6790167 GG基因型與海南漢族人肺癌的發(fā)生密切相關(guān)［14］。本研究顯示，TP63 rs6790167與海南漢族人肺腺癌的發(fā)病密切相關(guān)，G等位基因是非吸煙男性肺腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)基因，支持前期和Pathak的研究結(jié)論。

流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，吸煙是肺癌發(fā)生最主要的危險(xiǎn)因素，占肺癌死亡相關(guān)的85%～90%［15］。迄今為止，吸煙導(dǎo)致的肺癌發(fā)生的分子機(jī)制并不完全明確。吸煙所致的氧化應(yīng)激和慢性炎癥是肺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，TP63從中起著非常重要的作用。吸煙可誘導(dǎo)ΔNp63表達(dá)增加，進(jìn)而調(diào)控一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和COX-2的表達(dá)增加，而NOS和COX-2的高水平表達(dá)是肺癌發(fā)生的重要原因之一［16-17］。然而，本研究的數(shù)據(jù)顯示，在吸煙的男性人群中TP63 rs6790167多態(tài)性與肺癌的易感性無關(guān)，在非吸煙男性人群中TP63 rs6790167 GG基因型肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于AG或AA基因型，這支持Wang等［18］的研究結(jié)果。類似的其他研究也提示TP63 rs10937405、rs448880、rs7631358的多態(tài)性與非吸煙人群的肺腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)［19-21］。本研究認(rèn)為，由于吸煙是強(qiáng)致癌因素，可能掩蓋了TP63 rs6790167多態(tài)性與肺癌的易感性之間的關(guān)聯(lián)，且同時(shí)入組的非吸煙的男性人群的樣本量較小，所以未能產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，本研究認(rèn)為TP63 rs6790167多態(tài)性與海南漢族人肺腺癌的發(fā)生有關(guān)，對非吸煙男性人群肺腺癌的發(fā)生可能具有預(yù)測作用。

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（2017-04-05收稿）

（2017-05-31修回）

Association of the polymorphisms in TP63 rs6790167 with risk for lung cancer in Hainan Han population

Wenjun TANG1,Qixing YAN2,Tianzhu WANG3,Guohui YI4,Li XUE4,Haifeng LIN3

1Department of Gerontology Medicine;2Department of Pharmacy;3Department of Medical Oncology,Second Affiliated Hospital,Hainan Medical College,Haikou 570311,China;4Science Research Center,Hainan Medical College,Haikou 571101,China

Haifeng LIN:E-mail:13322060949@163.com

Objective:To evaluate the association between the polymorphisms in TP63 rs6790167 and lung cancer.MethodsWe performed a case-control study with 258 patients and 270 controls.Genomic DNA was extracted using a blood genome extraction kit.Genotyping was conducted using allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR).Results:No significant difference was observed in the genotype of TP63 rs6790167 between cases and controls,and allele frequencies significantly elevated in the cases(P=0.045).In a further stratified analysis by gender and smoking status,the frequencies of the GG genotype and G allele of rs6790167 were significantly higher in non-smoking male patients with lung adenocarcinoma(P=0.000,P=0.001),individuals with GG genotype had a higher risk for lung adenocarcinoma in non-smoking man(OR=6.66,95%CI:2.16-20.41).Individuals with G allele had a higher risk for lung adenocarcinoma in a non-smoking man(OR=2.54,95%CI:1.42-4.56)in comparison with individuals with A allele.Conclusion:We found that the polymorphisms of TP63 rs6790167 were associated with the risk for lung adenocarcinoma in non-smoking men and that these polymorphisms may be a predictor for lung adenocarcinoma in non-smoking men.

TP63,lung cancer,single-nucleotide polymorphism,susceptibility,Hainan

①海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年病科（海口市570311）；②藥學(xué)部；③腫瘤內(nèi)科；④海南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室

林海鋒 13322060949@163.comm

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.21.400

唐文軍 專業(yè)方向?yàn)榉伟┰缙谠\斷研究。E-mail：18889188505@163.com