黃春秀 董煥嫦 吳海燕 譚志軍 李 揚①

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室 廣州 510631;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室 廣州 510631;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室 青島 266071)

福氏擬菱形藻(Pseudo-nitzschia fukuyoi)
——中國產(chǎn)毒擬菱形藻的新記錄*

黃春秀1,2董煥嫦1,2吳海燕3譚志軍3李 揚1,2①

(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室 廣州 510631;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室 廣州 510631;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室 青島 266071)

為了提高對我國海域擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschia)物種多樣性的認識,并明確其是否能夠產(chǎn)生多莫酸(domoic acid,DA)。本文從中國沿海分離和建立了擬菱形藻的單克隆培養(yǎng)株系,結(jié)合光學(xué)顯微鏡下的群體特征、透射電鏡下的超微形態(tài)學(xué)特征、基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù),以及基于ITS2轉(zhuǎn)錄RNA的二級結(jié)構(gòu)分析,鑒定到我國擬菱形藻屬的1個新記錄種:福氏擬菱形藻(P.fukuyoiLim,Teng,Leaw &Lim)。本文對其形態(tài)學(xué)特征進行描述,與相似物種進行了對比分析;對其 ITS2-RNA序列進行了分析;利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)對培養(yǎng)藻株的產(chǎn)毒特征進行了分析,多個株系中均檢測到DA,單細胞產(chǎn)毒水平為0.02—0.23pg,這是我國報道的第二種產(chǎn)毒擬菱形藻。利用鹵蟲(Artemia salina)和褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)對福氏擬菱形藻的產(chǎn)毒水平進行了誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)浮游動物能夠提高福氏擬菱形藻的DA含量,增強幅度在4.7—28.5倍之間。本文提高了對我國擬菱形藻屬物種多樣性的認識,明確了福氏擬菱形藻的產(chǎn)毒特征和水平,為后續(xù)深入研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

福氏擬菱形藻;物種多樣性;形態(tài)學(xué)特征;核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū);ITS2-RNA 二級結(jié)構(gòu);多莫酸

擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaPeragallo)廣泛分布于全球近岸水域,是記憶缺失性貝毒(amnesic shellfish poisoning,ASP)——多莫酸(domoic acid,DA)的重要生物來源(Lelonget al,2012;Traineret al,2012)。自1987年引發(fā)首次ASP中毒事件之后(Bateset al,1989),擬菱形藻和DA備受關(guān)注。DA能夠沿著食物鏈在各級海洋生物體內(nèi)累積,并最終危害鳥類、海獅、鯨魚、人類等高等動物(Lelonget al,2012;Traineret al,2012)。截至目前,全球已記錄了 49種擬菱形藻,其中有26種能夠產(chǎn)生DA(Tenget al,2016;Liet al,2017;Moestrupet al,2017)。

以往研究發(fā)現(xiàn)擬菱形藻在我國沿海廣泛分布(呂頌輝等,1992;錢宏林等,2000;陳菊芳等,2002;李揚等,2010;Lüet al,2012),并常常在春季和夏季達到較高細胞豐度,甚至引發(fā)藻華(陳菊芳等,2005;Lüet al,2012)。另外,全球已報道的能夠產(chǎn)生DA的26個擬菱形藻物種之中(Tenget al,2016;Liet al,2017;Moestrupet al,2017),有16種在我國沿海有分布(李揚等,2010;Lüet al,2012;徐國雙等,2015;Liet al,2017)。我國學(xué)者曾對中國海域多個擬菱形藻物種,如尖刺擬菱形藻(P.pungens)(Liet al,2005)、尖細擬菱形藻(P.cuspidata)和多紋擬菱形藻(P.multistriata)(邢小麗等,2007)、銀河擬菱形藻(P.galaxiae)和微孔擬菱形藻(P.micropora)(徐國雙等,2015)、并基擬菱形藻(P.decipiens)(黃春秀等,2017)等開展產(chǎn)毒能力研究,均未檢測到DA。但是,Li等(2017)在廣東沿海分離鑒定了一個新種:偽裝擬菱形藻(P.simulans),并在其培養(yǎng)株系中檢測到 DA,單細胞產(chǎn)毒水平是 1.05—1.54×10-3pg,這是關(guān)于我國產(chǎn)毒擬菱形藻的唯一報道。但這并不意味著我國海域中產(chǎn)毒擬菱形藻物種多樣性低,因為近年在我國沿海多個區(qū)域的海產(chǎn)品中均檢出DA,如大連、湛江、北海和舟山海域(宋琍琍等,2008;吉薇等,2011;王恒,2011),這表明中國海域DA分布廣泛,且作為海域DA重要產(chǎn)生者——可產(chǎn)毒的擬菱形藻在我國近海分布也可能較為廣泛,物種多樣性也較高。但目前相關(guān)認識還非常少,因此本文基于建立的單克隆培養(yǎng)株系,對中國沿海擬菱形藻開展了種源信息和產(chǎn)毒特征的分析,增加對我國海域擬菱形藻屬物種多樣性和產(chǎn)毒能力的認識。

1 材料和方法

1.1 單克隆藻株的建立

本實驗室于2016年 8月在廣東大亞灣海域,利用浮游植物網(wǎng)(孔徑 10μm)進行水平拖網(wǎng),并盡快帶回實驗室。利用毛細管復(fù)洗法在倒置顯微鏡(Mshot MI-12,廣州明美科技有限公司,中國)下分離目標藻細胞,經(jīng)過多次水洗和轉(zhuǎn)移,以確保目標藻的純化。最后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滴有L1培養(yǎng)基的48孔細胞培養(yǎng)板中(Guillardet al,1993;Lundholmet al,2006),放置在光照強度約 50—80μmol photons/(m2·s)、光周期 12h﹕12h、溫度20±2°C的條件下培養(yǎng)。待其存活并繁殖達到約 100個藻細胞之后,轉(zhuǎn)移到盛有 L1培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中培養(yǎng),以MC(Marine collection)序列進行編號。

1.2 鹵蟲和輪蟲的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

將市場中購買的鹵蟲(Artemia salina)卵置于濃度200mg/L的福爾馬林溶液中浸泡30min消毒,再用滅菌人工海水沖洗至無氣味,投入經(jīng)過滅菌處理的 L1培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度等條件與擬菱形藻培養(yǎng)條件一樣。約10d后,將10—20個成體的鹵蟲用毛細管復(fù)洗法轉(zhuǎn)移到盛有 L1培養(yǎng)基(已加入約 100個藻細胞)的錐形瓶中。同樣,將市場上購買回來的褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)活體,用毛細管復(fù)洗法分離10—20個轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。然后放置在光照強度約50—80μmol photons/(m2·s)、光周期 12h﹕12h、溫度20±2°C 的條件下培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡(light microscopy,LM)觀察:取處于對數(shù)生長期的藻液 0.1mL,滴在載玻片上,蓋上玻片后,利用正置光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53,日本)進行微分干涉(differential interference contrast,DIC)的觀察,并使用Olympus DP27數(shù)碼相機拍照,在Olympus CellSens軟件上獲取圖像信息。主要觀察群體特征、細胞色素體形態(tài)等。

透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察:取對數(shù)生長期的藻液 2mL,加入等量濃硫酸(＞95%)以去除有機質(zhì),然后用蒸餾水多次水洗至中性(徐國雙等,2015)。用微量進樣器吸取5—10μL酸化后的水樣,滴加在噴鍍碳膜的銅網(wǎng)(100目)上,自然晾干后,即可在透射電鏡(日立JEM-1010,日本)下觀察和拍照。主要觀察殼面超微結(jié)構(gòu),如點條紋、肋突、孔紋等。

1.4 分子系統(tǒng)學(xué)分析

離心法收集處于對數(shù)生長期的藻細胞,進行總DNA的提取(Lundholmet al,2002)。利用引物ITS1和ITS4進行核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴增和測序(Limet al,2013)。PCR產(chǎn)物送至上海立菲生物科技有限公司進行純化和測序。從NCBI下載擬菱形藻種類的ITS nrDNA序列,使用BioEdit軟件進行序列的比對和矩陣(Limet al,2013)。基于MrModeltest 2.3軟件的計算,選擇最適模型和參數(shù)為GTR+I+G,用MrBayes 3.2軟件(Ronquistet al,2012)構(gòu)建貝葉斯推理樹(Bayesian inference,BI),用RAxML-HPC2軟件(Milleret al,2010)構(gòu)建最大似然樹(maximum likelihood,ML)。以奇異棍形藻(Bacillaria paxillifer)、新月細柱藻(Cylindrotheca closterium)和船斑菱形藻(Nitzschia navis-varingica)為群外對照(Tenget al,2014)。

1.5 ITS2二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及CBCs分析

從GenBank下載福氏擬菱形藻的ITS nrDNA序列,參考序列標注,將其ITS2片段截下。使用Mfold軟件(Percopoet al,2016)在線預(yù)測其ITS2的二級結(jié)構(gòu),所得二級結(jié)構(gòu)含4個環(huán)和一個擬菱形藻屬環(huán)。以福氏擬菱形藻的二級結(jié)構(gòu)為同源模板,使用 ITS2 Database軟件(Percopoet al,2016)在線預(yù)測本文的5個福氏擬菱形藻單克隆株系,與其親緣關(guān)系最接近的偽柔弱擬菱形藻(P.pseudodelicatissima)和尖細擬菱形藻的RNA二級結(jié)構(gòu)。最后使用VARNA軟件(Limet al,2013)觀察并下載二級結(jié)構(gòu)。同時使用 4SALE v.1.7軟件(Limet al,2013)中自帶的補償堿基變化(compensatory base changes,CBCs)功能觀察CBC差異,分析生殖隔離情況。

1.6 LC-MS/MS法檢測藻毒素

取處于生長穩(wěn)定期中后期的藻液 300—600mL,藻細胞濃度約5×105cell/mL,經(jīng)0.2μm醋酸纖維濾膜過濾,壓力不高于0.5Pa,收集藻細胞立刻置于-20°C冰箱中保存;另外取5mL混勻的藻細胞加2mL魯格試劑于-4°C保存,用于單細胞產(chǎn)毒量的計算。將已收集的藻細胞加4mL甲醇水(甲醇﹕水=1﹕1)充分混勻,用超聲波細胞粉碎機冰浴破碎5min,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,濾液于-20°C下保存?zhèn)溆谩１緦嶒灅悠方约耐袊a(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所上機檢測。

采用Prominence UFLC超快速液相色譜(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(SCIEX公司)對預(yù)處理的樣品進行DA檢測,參見Wu等(2014)方法進行分析。DA標準品購自德國Sigma公司。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)描述

福氏擬菱形藻(Pseudo-nitzschia fukuyoiLim,Teng,Leaw &Lim)(圖1a—g)細胞具有兩個黃褐色的色素體,對稱分布在橫軸兩側(cè),可形成鏈狀群體,細胞間重疊部為殼面全長的1/4—1/5(圖1a,b)。細胞殼面呈線形至披針形(圖1a,b),殼面兩端相似,呈箭頭狀(圖1c,d),環(huán)面觀時兩殼端形狀稍微呈S型(圖1b)。殼面長49—55μm,寬2.1—2.5μm。管殼縫強烈偏心,具有中央較大船骨點(圖1e)。殼套高1—2個孔紋,中部高2個孔紋(圖1e),接近兩端高1個孔紋(圖1d)。肋突分布在殼緣,排列不規(guī)則(圖1e),密度為16—21個/10μm。點條紋由一排孔紋組成(圖 1e,f),密度為34—39條/10μm?？准y形狀為圓形或方形,孔紋內(nèi)部的篩板膜分成1—5個分區(qū),以2—3個分區(qū)為主,每個分區(qū)為不規(guī)則的六邊形,可見少部分分區(qū)在孔紋中央(圖1f),孔紋密度為4—6個/1μm?？捎^察到三條環(huán)帶,殼環(huán)帶寬2個孔紋,高3—4個孔紋,點條紋密度44—46個/10μm(圖1h),孔紋內(nèi)部有裂縫,分成不規(guī)則的六邊形,接近兩端出現(xiàn)殼環(huán)帶高 2個孔紋(圖1g);第二條環(huán)帶點條紋由一排孔紋組成(圖 1g),孔紋內(nèi)部都是由六邊形的篩孔構(gòu)成(圖1g)。第三條環(huán)帶只有一排縱向排列的孔紋。

圖1 福氏擬菱形藻的顯微照片F(xiàn)ig.1 Microscope images of Pseudo-nitzschia fukuyoi

圖2 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-5.8S-ITS2的最大似然樹Fig.2 Maximum likelihood tree inferred from ITS1-5.8S-ITS2 rDNA

本種營海水浮游生活,此前有產(chǎn)生 DA的報道,單細胞產(chǎn)毒量為3.85—4.54pg(Daoet al,2015),本文亦檢測到 DA的存在,單細胞產(chǎn)毒水平為0.02—0.23pg。本種采自廣東大亞灣(8月),也曾報道被發(fā)現(xiàn)于馬來西亞和越南(Limet al,2013;Daoet al,2015;Tenget al,2016)。

2.2 基于ITS序列分析的分子系統(tǒng)學(xué)分析

對ITS1-5.8S-ITS2序列的972個堿基進行了比對分析,建立的最大似然樹和貝葉斯推理樹具有相同的結(jié)構(gòu),合并形成圖2。MC3284、MC3286、MC3303和MC3323的基因完全相同,與MC3344有1個堿基的差異。前 4個株系與馬來西亞株系 PnKk36、Pnmi158的基因完全相同,與馬來西亞株系PnTb25、PnTb39有 1個堿基差異,但是與馬來西亞株系PnLk02遺傳差異較大,有6個堿基差異。由于越南株系Pn5、Pn6的ITS序列尚未上傳到NCBI,因此暫未作比對。本文建立的5個株系與已報道的5株馬來西亞福氏擬菱形藻聚在同一個分支上,且具有較高的置信值(BPP=1,ML=99),這表明分子分類的結(jié)果也支持形態(tài)鑒定的結(jié)論。

2.3 ITS2二級結(jié)構(gòu)分析

福氏擬菱形藻的ITS2二級結(jié)構(gòu)模型具有四個單環(huán)和一個擬環(huán)IIa(圖3),與已報道的福氏擬菱形藻的ITS2二級結(jié)構(gòu)基本一致(Limet al,2013)。福氏擬菱形藻ITS2-RNA的標志性區(qū)間位于helix III和helix IV,33-bp信號區(qū)域:5'-CCATTTGGCAAGCCTGGATGGT TTCTAAGTCTA-3'。本文 4個福氏擬菱形藻株系(MC3284、MC3286、MC3303、MC3323)與之前報道的馬來西亞株系 PnKk36、Pnmi158具有完全一致的ITS2二級結(jié)構(gòu),與MC3344和馬來西亞株系PnTb25、PnLk02只有 1個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的差異,沒有 CBC 和hemi-CBC(HCBC)的差異,這表明ITS2二級結(jié)構(gòu)的結(jié)論亦支持形態(tài)學(xué)與分子分類的鑒定結(jié)果。將本文的福氏擬菱形藻與系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系最近的偽柔弱擬菱形藻(8A10,P-11)和尖細擬菱形藻(AL-17,Sydney1)相比較,發(fā)現(xiàn)與前者有1個CBC和4個SNPs的差異,與后者有1個CBC,1個HCBC和6個SNPs的差異。

2.4 DA產(chǎn)毒特征

圖3 福氏擬菱形藻ITS2二級結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The secondary structure of ITS2-RNA in Pseudo-nitzschia fukuyoi strain MC3286

以 DA 標準品濃度(μg/mL)為橫坐標,峰面積為縱坐標,建立LC-MS/MS檢測DA的標準曲線,DA濃度為50—500μg/L時,其峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系(R2=0.99934),回歸方程為y=164.64875x-3947.22457。本方法的檢測下限為50ng/mL。DA的出峰保留時間為0.77min。對常規(guī)培養(yǎng)和浮游動物誘導(dǎo)的福氏擬菱形藻進行 LC-MS/MS檢測,結(jié)果在預(yù)定的保留時間內(nèi)都出現(xiàn)樣品峰,檢出量見表1。這也是我國報道的能夠產(chǎn)生DA的第二個擬菱形藻物種。

表1 DA的檢出結(jié)果Tab.1 The results of DA content detected in this study

另外,本文對 2株福氏擬菱形藻(MC3323,MC3344)進行了浮游動物混培誘導(dǎo)實驗。結(jié)果顯示(表1):MC3323株系在鹵蟲的誘導(dǎo)下,DA水平增加了7倍,在褶皺臂尾輪蟲誘導(dǎo)后增加了 4.7倍;而株系MC3344在鹵蟲的作用下產(chǎn)DA量只增加了5.4倍,但是在褶皺臂尾輪蟲的誘導(dǎo)下增加量高達 28.5倍。因此,鹵蟲和褶皺臂尾輪蟲都能提高福氏擬菱形藻的DA產(chǎn)毒水平。

3 討論

3.1 福氏擬菱形藻與相似種的比較研究

福氏擬菱形藻的形態(tài)特征是殼面呈線形至披針形,具有中央船骨點,點條紋由單排孔紋組成,屬于偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群(P.pseudodelicatissimacomplex)(Limet al,2013)。在最初的研究中,對于偽柔弱擬菱形藻的認知較為籠統(tǒng),將所有點條紋由單排孔紋組成的物種都歸為偽柔弱擬菱形藻。但是隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)該種形態(tài)多樣,產(chǎn)毒特征也不穩(wěn)定,或許存在(擬)隱形種。Lundholm等(2003)對點條紋由單排孔紋組成的擬菱形藻進行了二次研究,提出了偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群的概念,認為偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群物種的主要形態(tài)特征有:(1)殼面呈線形或披針形;(2)點條紋由單排孔紋組成;(3)具有中央較大船骨點;(4)具有相似的殼套和殼環(huán)帶結(jié)構(gòu)(Lundholmet al,2003;李揚等,2010)。然而該復(fù)合群物種間的形態(tài)學(xué)差異需要在電子顯微鏡下才能區(qū)分出來,關(guān)鍵區(qū)別特征是孔紋內(nèi)部的小孔數(shù)量和排列方式(Lundholmet al,2003;Limet al,2013;Tenget al,2016)。截止目前,偽柔弱擬菱形藻復(fù)合群中的物種已經(jīng)豐富到23個種(Liet al,2017)。

本研究的福氏擬菱形藻(2.1—2.5μm;16—21μm;34—39μm)在寬度、肋突和點條紋上與以往報道的越南株系(1.53—2.28μm;16—21μm;33—37μm)更為接近(Daoet al,2015),而在孔紋密度(4—6個)和殼環(huán)帶上的點條紋密度(44—46μm)則與已報道的馬來西亞株系(4—7 個;39—47μm)更為接近(Limet al,2013)。無論是在形態(tài)學(xué)還是遺傳學(xué)上,福氏擬菱形藻的最相似種類都是尖細擬菱形藻和偽柔弱擬菱形藻(Limet al,2013)。但是本文福氏擬菱形藻的寬度(2.1—2.5μm)明顯高于尖細擬菱形藻(1.4—2.0μm)和偽柔弱擬菱形藻(0.9—1.6μm),而在肋突密度、點條紋密度和環(huán)帶上的點條紋密度上,本實驗株系(16—21μm;34—39μm;44—46μm)明顯低于尖細擬菱形藻(19—25μm;35—44μm;47—53μm)和偽柔弱擬菱形藻(20—25μm;36—43μm;48—55μm)(Lundholmet al,2003)。三者最明顯的區(qū)別在于,孔紋內(nèi)的篩板膜分區(qū)有所差異,前者孔紋被硅質(zhì)橋分成1—5部分,以2—3個分區(qū)為主,而且出現(xiàn)部分分區(qū)位于孔紋中央,而后兩者孔紋內(nèi)部主要分成2部分,為上下不規(guī)則的2部分(Lundholmet al,2003;Limet al,2013)?？傊?擬菱形藻屬不同物種之間的形態(tài)學(xué)差異非常細微,以超微形態(tài)學(xué)特征對其進行鑒定仍存在著不少困難,所以本文結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)對福氏擬菱形藻進行了物種識別。

3.2 擬菱形藻屬DA產(chǎn)毒特征分析

福氏擬菱形藻首次報道于馬來西亞(Limet al,2013),當時作為擬菱形藻屬的新物種進行報道,并未對其產(chǎn)毒特征進行檢測。之后報道于越南海域,并檢測到高濃度 DA,產(chǎn)毒量為3.85—4.54pg/cell(Daoet al,2015)。本文從大亞灣水域分離并建立了5個福氏擬菱形藻培養(yǎng)株系,利用 LC-MS/MS技術(shù)對其產(chǎn)毒特征進行檢測,均能檢測到 DA,單細胞產(chǎn)毒量為0.02—0.23pg,低于越南株系的產(chǎn)毒水平。以往研究也已證實,擬菱形藻產(chǎn)毒是一個比較復(fù)雜的情況,不同海域同種擬菱形藻產(chǎn)DA特征也存在差異,如采自新西蘭一些水域的尖刺擬菱形藻可產(chǎn) DA(徐國雙等,2015),而采自中國沿海的尖刺擬菱形藻卻沒有檢測到DA(Liet al,2005)。同樣,采自馬來西亞一些水域的柯氏擬菱形藻(P.kodamae)可產(chǎn)生DA,但采自東馬來西亞一些海域的柯氏擬菱形藻卻沒有檢測到DA(Tenget al,2016)。這表明擬菱形藻是否產(chǎn)毒不是一個穩(wěn)定特征。而且有研究認為,產(chǎn)毒擬菱形藻的生理特征與生長的環(huán)境因子如生長周期、硅、氮、磷、光照與光周期、細菌的共生等都會影響其產(chǎn)DA的量(Lelonget al,2012)。

3.3 浮游動物對擬菱形藻產(chǎn)毒特征和水平的影響

目前已經(jīng)認識到有較多因素能夠影響擬菱形藻的DA產(chǎn)毒特征和水平,以往研究多集中在擬菱形藻的培養(yǎng)因子上,如物理參數(shù)(溫度、鹽度、光照和pH)、營養(yǎng)參數(shù)(Si、P、N、Fe、Cu)和生物參數(shù)(細菌、病毒和真菌)(Lelonget al,2012)。然而近年來有學(xué)者從捕食關(guān)系的角度,分析了浮游動物對于擬菱形藻產(chǎn)毒的影響。如有學(xué)者將產(chǎn)毒的成列擬菱形藻(P.seriata)與不產(chǎn)毒的格式擬菱形藻(P.granii)分別與橈足類Calanus copepodites放在一起,發(fā)現(xiàn)成列擬菱形藻產(chǎn)毒水平有所上升,而在橈足類的誘導(dǎo)下格式擬菱形藻也能夠產(chǎn)生DA(Tammilehtoet al,2015)。研究認為,橈足類與擬菱形藻屬于食物鏈中的捕食關(guān)系,擬菱形藻增加 DA水平,可以降低捕食者的攝食率(Tammilehtoet al,2015)。本文進行的浮游動物誘導(dǎo)實驗中,也驗證了上述觀點。在浮游動物誘導(dǎo)實驗中,無論是加入鹵蟲,還是褶皺臂尾輪蟲,均能夠增加福氏擬菱形藻的產(chǎn)毒水平,最高可增加28.5倍。本文的誘導(dǎo)實驗說明,浮游動物能夠顯著刺激有毒擬菱形藻的產(chǎn)毒水平,而浮游動物的缺失,也可導(dǎo)致有毒擬菱形藻的產(chǎn)毒能力大大降低,這或許可以解釋為什么我國擬菱形藻在實驗室培養(yǎng)條件下極少檢測到DA,而在自然海域如浮游植物樣品中卻有高含量 DA(Liet al,2017)。

4 結(jié)論

(1)本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù),鑒定到我國擬菱形藻屬的 1個新記錄種:福氏擬菱形藻,增加了我國擬菱形藻屬的物種多樣性。

(2)本文建立的5個福氏擬菱形藻株系中均能檢測到 DA,單細胞產(chǎn)毒量為0.02—0.23pg,這是我國報道的第二個能夠產(chǎn)生DA的擬菱形藻物種。

(3)利用鹵蟲和褶皺臂尾輪蟲對福氏擬菱形藻的產(chǎn)毒特征與水平進行了誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)浮游動物能夠促使擬菱形藻的DA水平,增加幅度在4—28倍之間。

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PSEUDO-NITZSCHIA FUKUYOI—A NEW RECORD OF TOXICPSEUDO-NITZSCHIATAXA FROM CHINA

HUANG Chun-Xiu1,2, DONG Huan-Chang1,2, WU Hai-Yan3, TAN Zhi-Jun3, LI Yang1,2
(1.Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou510631,China;2.Guangdong Provincial key Laboratory of Healthy and Safe Aquaculture,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou510631,China;3.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality,Ministry of Agriculture,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao266071,China)

To clarify the species diversity of the genusPseudo-nitzschiain China and declare their domoic acid (DA)production,a set of monoclonal strains were isolated and established from Chinese coastal waters in this study.Based on the morphology under light microscope (LM)and transmission electron microscopy (TEM),and molecular analysis inferred from internal transcribed spacer (ITS)region of ribosomal rRNA encoding gene,and comparison of ITS2-RNA secondary structure,a new recordPseudo-nitzschiaspecies for China was identified:P.fukuyoiLim,Teng,Leaw &Lim.Its morphological features was described in detail and compared with similar species,and the unique molecular feature for the secondary structure of ITS2-RNA was analyzed.Using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)injection,DA could be detected from all five establishedP.fukuyoistrains,with concentrations around 0.02-0.23 pg cell-1.In addition,Artemia salinaandBrachionus plicatiliswere used to mix-culture withP.fukuyoistrains,to evaluate the impact on the ability of DA-production.The result show that the existence of zooplankton could increase DA-production level ofP.fukuyoifor 4.7–28.5 times.The discovery enriches the diversity of the genusPseudo-nitzschiain China,and report a new toxicPseudo-nitzschiaspecies,P.fukuyoi,which can provide basic data for further studies.

Pseudo-nitzschia fukuyoi;diversity;morphology;internal transcribed spacer;ITS2-RNA secondary structure;domoic acid

Q949.2

10.11693/hyhz20170200032

* 國家自然科學(xué)基金項目,31570205號,31370235號;廣州市科技計劃項目,201607010370號。黃春秀,碩士研究生,E-mail:3127166788@qq.com

① 通訊作者:李 揚,研究員,碩士生導(dǎo)師,E-mail:liyang@scnu.edu.cn

2017-02-18,收修改稿日期:2017-06-01