陳 銳 趙玲俠 孫曉宇 瞿 佳 路鵬鵬 沈衛(wèi)榮

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

陜北石油污染區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)解析*

陳 銳 趙玲俠 孫曉宇 瞿 佳 路鵬鵬 沈衛(wèi)榮

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

為了解陜北地區(qū)石油污染對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，采用高通量測序?qū)κ臀廴就寥乐屑?xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，考察了石油污染土樣的理化性質(zhì)、可培養(yǎng)微生物數(shù)量及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，探討石油污染程度與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。結(jié)果表明，石油污染土樣中殘油量為28.7～870.0 mg/kg，相對于未污染土樣，石油污染土樣的總碳隨殘油量的增加呈增加趨勢。石油污染土樣中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量大于未污染土樣，而可培養(yǎng)放線菌數(shù)量則相反。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，石油污染土樣中細(xì)菌群落數(shù)量顯著低于未污染土樣，操作分類單元(OTU)數(shù)從未污染土樣的7 707個最低下降到2 034個，且物種豐富度顯著降低，其中厚壁菌門、放線菌門及變形菌門為優(yōu)勢菌群，隨土壤殘油量增加，厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門比例顯著上升，而酸桿菌門、芽單胞菌門等比例則顯著降低。

石油污染 微生物群落結(jié)構(gòu) 微生物多樣性

地處毛烏素沙地南緣與陜北黃土丘陵溝壑區(qū)接壤地帶的陜北油氣開采區(qū)，土壤中礦物鹽含量高，有機(jī)質(zhì)含量低、土壤貧瘠[1]，土壤微生物種群和數(shù)量少。受石油開發(fā)的影響，部分土壤被石油污染，給當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境帶來極大威脅[2]。土壤微生物作為土壤微生態(tài)的重要組成部分，會隨環(huán)境變更發(fā)生群落結(jié)構(gòu)變化及種群消長[3]，由于土壤微生物對環(huán)境變化的感知靈敏、響應(yīng)及時，可作為土壤質(zhì)量的生物學(xué)監(jiān)測指標(biāo)。目前，對土壤微生物多樣性的研究已從傳統(tǒng)的微生物平板計數(shù)法發(fā)展出代謝圖譜、磷脂脂肪酸生物標(biāo)記、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)和末端限制性片段長度多樣性分析(T-RFLP)、熒光原位雜交、基因芯片技術(shù)及高通量測序技術(shù)等[4]。高通量測序技術(shù)通過提取土樣中微生物的DNA組，擴(kuò)增特定的基因片段，一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測序，使得對土壤微生物轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全面分析成為可能[5-6]。本研究采用高通量測序技術(shù)對石油污染土樣中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究，探討細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與不同程度的石油污染之間的關(guān)系，及石油污染對陜北脆弱生態(tài)環(huán)境帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試土樣采集于陜西省延長油田杏子川采油廠63號井場(36°52′N，109°18′E，海拔1 461 m)。將距石油采出井井架周圍0、1、5 m以及遠(yuǎn)離污染地區(qū)的土樣進(jìn)行采樣，采用5點(diǎn)采樣法采集表層(深度2～10 cm)的土樣作為研究樣本，采樣時樣品隨機(jī)編號，最終選取高水平石油殘留土樣(9#、3#、8#)、中水平石油殘留土樣(1#、11#)及未污染土樣(16#)進(jìn)行分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

土樣殘油量分析：取部分土樣風(fēng)干，過2 mm篩，采用紫外分光光度法測定土樣中殘油量[7]。方法如下：將1 g風(fēng)干土樣移入250 mL分液漏斗中，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的硫酸，按混合液質(zhì)量的2%加入氯化鈉，將20 mL石油醚移入分液漏斗，萃取，油層移入100 mL容量瓶中。重復(fù)至萃取完全后，用石油醚稀釋至標(biāo)線，以石油醚為空白試樣，在選定波長(254 nm)處測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算殘油量。

可培養(yǎng)微生物計數(shù)：取新鮮土樣5 g，加入到45 mL無菌生理鹽水中，振蕩30 min后梯度稀釋至10-5倍，細(xì)菌平板取10-3、10-4、10-5倍3個稀釋度，放線菌平板選擇10-2、10-3、10-4倍3個稀釋度，共涂布3組作為平行對照。細(xì)菌在35 ℃下培養(yǎng)24 h，放線菌在28 ℃下培養(yǎng)168 h，菌落基本成形即停止培養(yǎng)并計數(shù)。

基因組測序分析：取50 g土樣風(fēng)干后過2 mm篩，取20 g進(jìn)行土樣微生物基因組提取及高通量測序。測序后首先將優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)注釋，OTU數(shù)可以反映出樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。

多樣性指數(shù)分析：通過統(tǒng)計各土樣OTU數(shù)及各OTU中包含的序列數(shù)，利用Mothur軟件計算微生物的豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)、Ace指數(shù))以及多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù))。Chao指數(shù)與Ace指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，可以反映物種數(shù)量的差異。Simpson指數(shù)用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性，Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。Shannon指數(shù)是估算樣品中微生物均一性的常用指數(shù)之一，Shannon指數(shù)越大，說明群落均一性越高。

Bata多樣性分析:利用各樣品序列間的進(jìn)化及豐度信息來計算樣品間距離，進(jìn)行Bata多樣性分析以反映樣品之間是否有顯著的微生物群落差異。

細(xì)菌群落分類：將土樣中的細(xì)菌群落按照門水平分別進(jìn)行整理，計算各類群細(xì)菌所占比例，進(jìn)行細(xì)菌群落組成分析，可進(jìn)一步了解受石油污染影響，細(xì)菌群落組成的變化[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣理化性質(zhì)

各土樣理化性質(zhì)如表1所示。由表1可見，總體看來，5個石油污染土樣(1#、3#、8#、9#、11#)含水率差異不大，均高于未污染土樣(16#)。pH、總磷、總鉀在各土樣間無顯著差異，石油污染土樣與未污染土樣間總碳差異顯著，表現(xiàn)為隨著石油污染程度(殘油量)的加重，總碳含量有升高趨勢。

表1 土樣的理化指標(biāo)

2.2 可培養(yǎng)微生物分析

通過梯度稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法，統(tǒng)計土樣中可培養(yǎng)細(xì)菌及放線菌總數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 土樣中可培養(yǎng)微生物計數(shù)1)

注：1)同列數(shù)據(jù)后字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異顯著。

由表2可見，16#未污染土樣中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)為9.40×106cfu/g，其余石油污染土樣中除1#土樣外，其余4個土樣中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)均大于16#土樣，最高的8#土樣可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)達(dá)到25.50×106cfu/g，說明受石油污染影響使可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量普遍增加。16#未污染土樣中可培養(yǎng)放線菌總數(shù)為36.00×105cfu/g，5個石油污染土樣中可培養(yǎng)放線菌數(shù)量均遠(yuǎn)小于16#土樣，最低的9#土樣中可培養(yǎng)放線菌數(shù)量降至4.40×105cfu/g，石油污染土樣與未污染土樣間的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)、放線菌數(shù)差異均達(dá)到顯著水平。

2.3 細(xì)菌菌群多樣性

2.3.1 石油污染與細(xì)菌OTU數(shù)的關(guān)系

高通量測序后，對土樣微生物基因組中優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU標(biāo)記，共檢出18 618個OTU，各土樣的OTU數(shù)見表3。將各土樣的OTU數(shù)與土樣殘油量作圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，總體看來，隨著土樣殘油量增加，土樣中OTU數(shù)急劇降低，說明石油污染對土壤細(xì)菌數(shù)量影響顯著，說明石油污染與土壤細(xì)菌數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)。11#土樣的殘油量為28.7 mg/kg，而OTU數(shù)與16#土樣相比下降了45%，說明即使少量污染也會造成與未污染土樣間OTU數(shù)的巨大差異。

表3 各土樣的細(xì)菌OTU數(shù)

圖1 土樣殘油量與細(xì)菌OTU數(shù)的關(guān)系Fig.1 Relationship between OTU number and residual oil amount in soil samples

2.3.2 各指數(shù)與污染程度之間的關(guān)系

4個多樣性指數(shù)與土樣殘油量作圖，結(jié)果見圖2。由圖2可見，總體看來，Chao指數(shù)及Ace指數(shù)隨著殘油量的增加而降低，說明物種豐富度顯著降低。Simpson指數(shù)隨著殘油量的增加而升高，說明隨著石油污染程度加重，細(xì)菌群落的多樣性增高。Shannon指數(shù)隨著殘油量的增加而降低，說明隨著石油污染程度加重，細(xì)菌群落樣本的均一性降低。在陜北脆弱生態(tài)區(qū)，石油污染為土壤微生物帶來了特定的碳源，有利于可利用石油作為碳源的微生物多樣性的增加，因而顯示出細(xì)菌群落多樣性的增加而均一性降低。

圖2 各指數(shù)與土樣殘油量之間的關(guān)系Fig.2 Relationship between each index and residual oil amount in soil samples

2.3.3 Beta多樣性

采用主成分分析法分解Beta多樣性，分解出PC1、PC2兩個主成分，其中PC1、PC2分別解釋了26.4%、23.1%的變異。Bata多樣性分析可反映出土樣間是否有顯著的細(xì)菌群落差異，距離越近的土樣細(xì)菌群落差異越小。由圖3可見，9#、3#、8#土樣距離接近，1#、11#土樣距離接近，16#土樣距離其他樣本較遠(yuǎn)。這種群落差異分組恰好與污染程度一致，說明細(xì)菌群落差異的產(chǎn)生與石油污染程度高度相關(guān)，9#、3#、8#之間細(xì)菌群落差異較小，1#與11#之間細(xì)菌群落差異較小，這兩組與未污染的16#土樣細(xì)菌群落差異較大。

圖3 土樣的Beta多樣性分析Fig.3 Beta analysis of soil sample

2.3.4 門及科水平的細(xì)菌群落組成

將各土樣細(xì)菌群落OTU依照門水平進(jìn)行分類整理，計算出各門類細(xì)菌占樣本總檢出數(shù)量的比例，結(jié)果如表4所示?？梢?，厚壁菌門、放線菌門及變形菌門占總量的69%～94%，為所有樣本中的絕對優(yōu)勢菌群。在高水平石油殘留的9#、3#及8#土樣中，3大優(yōu)勢菌群占80%以上，在中水平石油殘留的1#、11#及無污染的16#土樣中則相對較低，占到69%～76%，受石油污染影響，酸桿菌門、芽單胞菌門等比例顯著降低，細(xì)菌群落的豐富度顯著降低，這一結(jié)果與大慶油田土樣的分析結(jié)果總體一致[9]。

表4 門水平的細(xì)菌群落組成

進(jìn)一步將各土樣細(xì)菌群落OTU依照科水平進(jìn)行分類整理，計算出各科細(xì)菌占樣本總檢出數(shù)量的比例，種群豐富度最高的為未被污染的16#土樣，檢出368個科，其他石油污染土樣中，9#土樣檢出210個科、3#土樣檢出271個科、8#土樣檢出309個科、1#土樣檢出274個科、11#土樣檢出247個科。其中鏈球菌科菌群在各土樣中占有主導(dǎo)地位，占總微生物菌群的20%～30%。另有研究表明，乳球菌在石油廢水處理中起重要作用[10]。在石油污染土樣中，纖維素單胞菌科、克里斯滕森菌科、Anaerolinaceae科、黏土桿菌科、瘤胃球菌科、明串珠菌科及鹽硫桿狀菌科隨石油污染程度增加而比例增加，其中部分菌群據(jù)文獻(xiàn)報道與鹽堿、有機(jī)質(zhì)降解及石油降解有關(guān)[11-15]。

在未污染土樣中檢出的特有菌科為變形菌門的Kouleothrixaceae科、Entotheonellaceae科、多囊粘菌科、侏囊菌科、腐螺旋菌科及放線菌門的紅色桿菌科、束絲放線菌科、高溫單孢菌科，受石油污染影響該類菌群種類多樣性顯著降低。

3 結(jié) 論

(1) 5個受石油污染的土樣(1#、3#、8#、9#、11#)之間含水率總體差異不顯著，但均高于未污染的16#土樣。受石油污染影響，土樣pH、總磷、總鉀在各土樣間無顯著差異，石油污染土樣與未污染土樣間總碳差異顯著，表現(xiàn)為隨著石油污染程度的加重，總碳含量呈升高趨勢。

(2) 對陜北地區(qū)石油開采區(qū)土樣的可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌進(jìn)行計數(shù)，證實(shí)受石油污染影響，土樣細(xì)菌數(shù)量增加，放線菌數(shù)量則急劇降低，石油污染土樣與未污染土樣的可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌的差異達(dá)到顯著水平。

(3) 6個土樣共檢出18 618個OTU，隨著土壤中殘油量的增加，土樣OTU數(shù)急劇降低，說明石油污染對土壤細(xì)菌數(shù)量影響顯著，即使少量污染也會造成與未污染土樣之間的巨大差異。隨著石油污染程度增加，物種豐富度顯著降低、群落多樣性增強(qiáng)但均一性降低，呈現(xiàn)出種群單一的趨勢。通過Beta多樣性分析可知，高水平石油殘留土樣及中水平石油殘留土樣間細(xì)菌群落差異較小，污染土樣與未污染土樣之間細(xì)菌群落差異較大。受石油污染影響，厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門比例顯著增加，酸桿菌門、芽單胞菌門等比例顯著降低。

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MicrobialcommunitystructureinpetroleumpollutedsoilatnorthofShaanxi

CHENRui，ZHAOLingxia，SUNXiaoyu，QUJia，LUPengpeng，SHENWeirong.

(ShaanxiInstituteofMicrobiology,Xi’anShaanxi710043)

In order to investigate the change of soil microbial community structure cause by petroleum pollution at north of Shaanxi,high-throughput sequencing was used to analyze the soil microbial community structure in soil samples. Some physical and chemical properties and culturable microbial amount of soil samples were investigated，and the relationship between microbial community structure and petroleum polluted level was studied. Results showed that the contents of petroleum hydrocarbons in the petroleum polluted soil samples ranged from 28.7 to 870.0 mg/kg. Total carbon in petroleum-polluted soil samples increased significantly. The abundance of culturable bacteria was increased in petroleum-polluted soil,while abundance of actinomycetes was decrease significantly. High-throughput sequencing data showed that microbial diversity was decreased correlated with petroleum hydrocarbons content. The number of operational taxonomic units (OTU) decreased from 7 707 (unpolluted soil sample) to the lowest of 2 034,the community richness was also decreased significantly. Firmicutes,Actinobacteria and Proteobacteria were the most dominant populations in all of soil samples,whereas the Firmicutes,Bacteroidetes and Proteobacteria community content shifted up,and Acidobacteria and Gemmatimonadetes community content decreased with the increasing of petroleum hydrocarbon content.

petroleum pollution; microbial community structure; microbial diversity

陳 銳，女，1977年生，博士，副研究員，主要從事微生物多樣性及生物修復(fù)研究。

*西部之光人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No.K2012-02)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目(No.2011K08-31)；陜西省科學(xué)院人才培養(yǎng)專項(xiàng)(No.2014k-27)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.004

2017-03-06)