張健 李云 陳淑華 張冬琴 唐公恩

(臨沂市中心醫(yī)院 感染科 山東 臨沂 276400)

Smad7和IL-6在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及臨床意義

張健 李云 陳淑華 張冬琴 唐公恩

(臨沂市中心醫(yī)院 感染科 山東 臨沂 276400)

目的探討Smad7和IL-6在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及臨床意義。方法收集56例肝細胞癌患者術(shù)后肝癌組織及癌旁肝硬化組織，采用熒光定量 PCR檢測Smad7轉(zhuǎn)錄情況，免疫組化方法檢測 Smad7蛋白的表達水平，對比Smad7表達與患者一般臨床病理特征如年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤計數(shù)、組織病理分化、TNM 分期、是否存在包膜、門靜脈系統(tǒng)侵犯、血清甲胎蛋白(AFP)濃度以及血清HBsAg陽性率的關系。術(shù)前采用ELISA法檢測肝癌患者血清中IL-6表達水平，與36位健康體檢者血清IL-6水平對比。結(jié)果肝癌組織中Smad7轉(zhuǎn)錄水平低于對應癌旁肝硬化組織，肝癌組織中Smad7蛋白陽性表達率均低于癌旁肝硬化組織(P<0.05)。肝癌組織Smad7陽性表達組與陰性表達組在腫瘤大小、組織病理分化、TNM 分期、門靜脈系統(tǒng)侵犯方面比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝癌組血清中IL-6水平高于健康組(P<0.05)。結(jié)論原發(fā)性肝細胞癌中存在Smad7和IL-6的異常表達，Smad7和IL-6可能是評估患者病情新的生物標志物。

原發(fā)性肝細胞癌；Smad7；IL-6

肝細胞癌是臨床最常見的腫瘤之一，我國肝癌發(fā)病率高，且術(shù)后復發(fā)率高，患者生存狀況不佳[1-2]。因此，需要新的生物標記物來提高肝癌患者的早期診斷率，實現(xiàn)個體化治療，改善肝癌患者的生存狀況。研究表明，肝癌的發(fā)生發(fā)展與TGF-β信號通路密切相關，而Smad7是該通路的重要調(diào)控因子，可進一步引起IL-6水平的變化，與上皮細胞間質(zhì)變等過程有關[3]。多項研究表明，TGF-β信號通路與食管癌、胃癌、肺癌等腫瘤密切相關，提示Smad7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[4]。本研究旨在探討Smad7和IL-6在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及臨床意義，具體如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2010年1月至2013年12月在臨沂市中心醫(yī)院行肝癌根治術(shù)的56例患者作為肝癌組，均合并乙型病毒性肝炎肝硬化，術(shù)后病理切片證實為肝細胞癌。其中男42例，女14例；年齡30～68歲，平均(49.0±3.8)歲；低分化11例，中分化39例，高分化6例；伴門靜脈癌栓24例，無門靜脈癌栓32例；依據(jù)國際TNM分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期24例，Ⅳ期9例?；颊呤中g(shù)前均接受“恩替卡韋，1次/d，口服”抗病毒治療，術(shù)前均未接受任何放、化療等其他抗癌治療。分別取癌組織，癌旁肝硬化組織(距離癌組織邊緣2 cm)，所有標本均為肝癌根治術(shù)后獲得的新鮮標本，獲得標本后立即放入液氮罐中，多聚甲醛固定，經(jīng)HE染色證實為肝細胞癌。收集同期健康體檢者36例作為健康組。

1.2實驗主要試劑PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務公司完成。Trizol試劑購于invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TaKaRa公司。β-actin內(nèi)參、抗Smad7抗體、人IL-6 ELISA試劑盒均購于Sigma公司。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量PCR 提取癌組織及癌旁組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。β-actin作為實驗內(nèi)參，查詢Smad7基因序列，設計PCR引物序列。Smad7 上游引物序列：5’-AGC ACT GTG GTT TGG TAT CTG TCA G-3’；下游引物序列：5’-CAC CAG CTG TTT GGT ATC TGT CAG-3’。β-actin 上游引物序列：5’-GGT GTG ATG GTGGGT ATG GGT-3’；下游引物序列：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’，反應條件：首先94 ℃預變性15 s，然后擴增30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s。用SDS(2.4版)進行熒光數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析采用比較Ct(ΔΔCt)值的方法。

1.3.2免疫組化 采用二步法免疫組化步驟，癌組織和癌旁正常組織脫水、常規(guī)處理后，滴加經(jīng)PBS液稀釋的一抗，加入二抗，經(jīng)辣根過氧化物酶鏈霉卵白素液標記進行顯色，脫水，封片，于鏡下觀察。在HCC中Smad7的著色主要定位于胞質(zhì)，陽性顆粒為棕黃色。

隨機挑選每張切片中的5個100倍視野，于每個視野中計數(shù)100個細胞，得到陽性細胞所占百分比。所有切片結(jié)果的判讀均經(jīng)過兩位高年資有經(jīng)驗的病理學老師確認。

1.3.3ELISA 血清稀釋后加入反應孔中，常溫孵育1 h，緩沖液沖洗后加入二抗(包含在ELISA試劑盒中)孵育1 h，緩沖液沖洗干凈。加入底物顯色15 min，最后加入終止物。酶標儀450 nm處顯色，根據(jù)標準曲線計算血清中IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1HCC與肝硬化組織中Smad7mRNA的表達HCC組織中Smad7 mRNA相對表達水平低于癌旁肝硬化組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1HCC和癌旁肝硬化組織中Smad7 mRNA相對表達水平

2.2HCC及癌旁肝硬化組織中Smad7蛋白的表達HCC組織中Smad7蛋白表達水平低于癌旁肝硬化組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

A：Smad7在HCC組織中表達陰性；B：Smad7在肝硬化組織中表達陽性。

圖2HCC及癌旁肝硬化組織中Smad7蛋白的表達(400×)

2.3Smad7蛋白表達與HCC分化及臨床病理特征的關系HCC中Smad7蛋白陽性表達組與陰性表達組在腫瘤大小、組織病理分化、TNM 分期、門靜脈系統(tǒng)侵犯比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 Smad7蛋白表達與HCC臨床病理特征關系

2.4HCC患者及健康者血清中IL-6的表達HCC組血清中IL-6水平高于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 HCC組和健康組患者血清 中IL-6的表達水平

3 討論

目前臨床已經(jīng)廣泛研究TGF-β信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。在急性肝損傷發(fā)生時，TGF-β可抑制肝臟內(nèi)皮細胞的生長，在HCC晚期，TGF-β失去抑制細胞生長的作用轉(zhuǎn)而促進腫瘤細胞的增長[4]。Smad7是TGF-β的一個靶基因，為TGF-β家族細胞因子的一個生理性反饋抑制因子，在腫瘤發(fā)展的不同時期可能既有抑癌作用，也有促癌作用，在一些腫瘤中被闡釋為腫瘤促進因子，該作用主要通過負性調(diào)控TGF-β信號通路實現(xiàn)[5]。

除了對TGF-β信號通路的負性調(diào)控機制外，Smad7抑制腫瘤的作用可能是通過其他信號通路實現(xiàn)，如氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、NF-κB和信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號通路,該通路均被證實在HCC的進展中發(fā)揮重要作用[6]。研究顯示，如果特異性敲除小鼠肝臟細胞特異性的STAT3基因，肝癌的發(fā)生發(fā)展過程與野生型小鼠有明顯差異，提示STAT3對HCC的發(fā)展有至關重要的作用[7-8]。這些資料進一步提示IKKβ在肝細胞中的抑癌作用，Smad7可以通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抑癌作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除了Smad7的小鼠STAT3激活程度升高，HCC組低表達Smad7[10]。肝細胞具有在受到脂質(zhì)體或者肝細胞生長因子刺激時產(chǎn)生IL-6的能力，但在肝臟組織中，自分泌的白介素-6(IL-6)主要由巨噬細胞和庫夫細胞在腫瘤發(fā)展的初始階段產(chǎn)生[11-14]。研究表明，Smad7可抑制巨噬細胞產(chǎn)生IL-6。血清中IL-6的水平主要受慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化的影響，乙型肝炎病毒的X蛋白可以通過蛋白磷酸化調(diào)控IL-6的表達[15]。由于對中路細胞增殖及存活、腫瘤血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥的多重作用，IL-6具有較強的促癌活性[16-17]。IL-6可與其他細胞因子相互作用，通過產(chǎn)生和介導免疫反應對HCC的發(fā)展產(chǎn)生深遠影響。在肝臟細胞系中，一定濃度的IL-6可抑制腫瘤生長，當其濃度達到一定閾值后，抑癌和促癌間的平衡會喪失，進而促進腫瘤的發(fā)展[18-19]。研究表明，IL-6/STAT3可作為抑癌作用的Smad7的一個靶點，Smad7可能影響STAT3/pSTAT3蛋白的降解過程，比如通過影響泛素化的過程，該過程同其影響TGF-β的作用相似[20]。

本研究主要采用免疫組化及qRT-PCR檢測HCC組織及癌旁肝硬化組織中Smad7的表達水平，結(jié)果顯示HCC組織中Smad7蛋白的表達水平較癌旁肝硬化組織低(P<0.05)；HCC組血清中IL-6水平高于健康組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Smad7的低表達與腫瘤大小、組織病理分化、TNM 分期、門靜脈系統(tǒng)侵犯存在統(tǒng)計學差異。該結(jié)果提示肝癌中存在Smad7和IL-6的異常表達，Smad7和IL-6可能是評估患者病情的新的生物標志物。但兩者異常表達水平的具體機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

[1] Singal A G,El-Serag H B.Hepatocellular carcinoma from epidemiology to prevention: translating knowledge into practice[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2015,13(12):2140-2151.

[2] El-Serag H B.Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology,2012,142(6):1264-1273.

[3] Feng T,Dzieran J,Gu X,et al.Smad7 regulates compensatory hepatocyte proliferation in damaged mouse liver and positively relates to better clinical outcome in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Sci(Lond),2015,128(11):761-774.

[4] Xia H,Ooi L L,Hui K M.MicroRNA-216a/217-induced epithelial-mesenchymal transition targets PTEN and SMAD7 to promote drug resistance and recurrence of liver cancer[J].Hepatology,2013,58(2):629-641.

[5] He G,Yu G Y,Temkin V,et al.Hepatocyte IKKbeta/ NF-kappaB inhibits tumor promotion and progression by preventing oxidative stress-driven STAT3 activation[J].Cancer Cell,2010,17(3):286-297.

[6] Jiang L L,Zhao Y J,Li Y.Expressions and clinical significance of TGF-βRⅡ and NF-κB in oral squamous cell?carcinoma[J].Shanghai Kou Qiang Yi Xue,2016,25(6):729-733.

[7] Stolfi C,Marafini I,De Simone V,et al.The dual role of Smad7 in the control of cancer growth and metastasis[J].Int J Mol Sci,2013,14(12):23774-23790.

[8] 司方瑩,李朵璐,闞全程.STAT3與腫瘤關系研究進展[J].河南醫(yī)學研究,2014,23(6):159-160.

[9] Bruix J,Gores G J,Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma: clinical frontiers and perspectives[J].Gut,2014,63(5):844-855.

[10] Liu Y,Liu A,Li H,et al.Celecoxib inhibits interleukin-6/interleukin-6 receptor- induced JAK2/STAT3 phosphorylation in human hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Prev Res (Phila),2011,4(8):1296-1305.

[11] Norris C A,He M,Kang L I,et al.Synthesis of IL-6 by hepatocytes is a normal response to common hepatic stimuli[J].PLoS One,2014,9(4):e96053.

[12] Naugler W E,Sakurai T,Kim S,et al.Gender disparity in liver cancer due to sex differences in MyD88-dependent IL-6 production[J].Science,2007,317(5834):121-124.

[13] Sakurai T,He G,Matsuzawa A,et al.Hepatocyte necrosis induced by oxidative stress and IL-1 alpha release mediate carcinogen- induced compensatory proliferation and liver tumorigenesis[J].Cancer Cell,2008,14(2):156-165.

[14] Meniconi R L,Komatsu S,Perdigao F,et al.Recurrent hepatocellular carcinoma:A Western strategy that emphasizes the impact of pathologic profile of the first resection[J].Surgery,2015,157(3):454-462.

[15] Taniguchi K,Karin M.IL-6 and related cytokines as the critical lynchpins between inflammation and cancer[J].Semin Immunol,2014,26(1):54-74.

[16] Ara T,Declerck Y A.Interleukin-6 in bone metastasis and cancer progression[J].Eur J Cancer,2010,46(7):1223-1231.

[17] Jang J W,Oh B S,Kwon J H,et al.Serum interleukin-6 and C- reactive protein as a prognostic indicator in hepatocellular carcinoma[J].Cytokine,2012,60(3):686-693.

[18] Klausen P,Pedersen L,Jurlander J,et al.Oncostatin M and Interleukin 6 inhibit cell cycle progression by prevention of p27kip1 degradation in HepG2 cells[J].Oncogene,2000,19(32):3675-3683.

[19] Feng T,Dzieran J,Gu X,et al.Smad7 regulates compensatory hepatocyte proliferation in damaged mouse liver and positively relates to better clinical outcome in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Sci,2015,128(11):761-774.

[20] Pang X H,Zhang J P,Zhang Y J,et al.Preoperative levels of serum interleukin-6 in patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology,2011,58(110-111):1687-1693.

ExpressionofSmad7andIL-6inprimaryhepatocellularcarcinomaandclinicalsignificance

Zhang Jian, Li Yun, Chen Shuhua, Zhang Dongqin, Tang Gongen

(DepartmentofInfectiousDiseases,theCentralHospitalofLinyi,Linyi276400,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Smad7 and IL-6 in primary hepatocellular carcinoma and its clinical significance.MethodsThe hepatocellular carcinoma tissues and adjacent liver cirrhosis tissues of 56 patients with hepatocellular carcinoma were collected. The transcription level of Smad7 was detected by real-time PCR, and the expression of Smad7 protein was detected by immunohistochemical method. The relationship between expression of Smad7 and the general clinicopathological features such as age, sex, tumor size, tumor count, histopathological differentiation, TNM staging, presence of envelope, portal vein system invasion, serum alpha-fetoprotein (AFP) concentration and serum HBsAg were analyzed. Preoperative ELISA method was used to detect the expression of IL-6 in serum of patients with hepatocellular carcinoma, and compared with the level of serum IL-6 in 36 healthy subjects.ResultsThe expression of Smad7 protein in hepatocellular carcinoma tissues was lower than that in adjacent liver cirrhosis tissues, and the positive expression rate of Smad7 protein in hepatocellular carcinoma tissues was lower than that in adjacent liver cirrhosis tissues (P<0.05). The level of IL-6 in hepatocellular carcinoma group was higher than that in healthy group (P<0.05). The level of IL-6 in hepatocellular carcinoma group was significantly higher than that in healthy group(P<0.05), and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionThe expression of Smad7 and IL-6 was abnormal in hepatocellular carcinoma. Smad7 and IL-6 may be the new biomarkers to evaluate the condition of patients.

primary hepatocellular carcinoma; Smad7; IL-6

R 735.7

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.21.010

2017-04-05)