呂俊麗 游新勇 任志龍 劉中原

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，包頭 014010) (包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品工程學(xué)院2, 包頭 014035)

酶解水溶劑法提取莜麥多酚的工藝研究

呂俊麗1游新勇1任志龍2劉中原1

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，包頭 014010) (包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品工程學(xué)院2, 包頭 014035)

莜麥?zhǔn)莾?nèi)蒙地區(qū)特色作物之一，具有降血糖、降血脂等生理功能。為了研究莜麥中多酚的提取，以內(nèi)蒙古莜麥為原料，以多酚得率為依據(jù)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)酶解水溶劑法提取酚類物質(zhì)的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝為：復(fù)合酶用量0.8%，酶解時(shí)間80 min，酶解溫度55 ℃，pH值5.0，此時(shí)酚類物質(zhì)的得率為：2.950 mg/g。在此基礎(chǔ)上與微波輔助有機(jī)溶劑提取法比較，得出酶法提取多酚得率顯著高于微波輔助提取法。表明：在提取莜麥多酚方面，酶解水溶劑提取法優(yōu)于微波輔助有機(jī)溶劑提取法。

莜麥 酚類 酶解法

莜麥 (AvenasativaL.)屬于禾本科植物，是內(nèi)蒙古地區(qū)特色作物之一，其富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維、多酚等營(yíng)養(yǎng)成分，具有降血糖、降血脂、清除自由基等多種生理功能[1-2]。目前關(guān)于莜麥的研究和利用多停留在蛋白質(zhì)、油脂及膳食纖維方面，對(duì)多酚的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[3]。莜麥中的多酚類物質(zhì)在降血脂、降血壓、降低膽固醇、預(yù)防心腦血管疾病等方面有顯著的效果，可以作為功能性成分進(jìn)行提取。莜麥中游離態(tài)的酚類物質(zhì)最少，絕大多數(shù)酚類化合物以不溶解的結(jié)合狀態(tài)存在[4]，這給莜麥多酚的提取帶來(lái)了一定的困難。為了使莜麥中的結(jié)合態(tài)多酚釋放出來(lái)，有研究者通過(guò)發(fā)芽處理來(lái)增加莜麥中多酚類物質(zhì)的含量[5]，同時(shí)使得發(fā)芽后谷物的功能活性有所提高[6-8]。

為了有效獲取莜麥中的多酚，研究者們已通過(guò)多種途徑提取。最常用的方法是溶劑提取法[9]，此法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備需求低，但同時(shí)也存在處理時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低等缺點(diǎn)。另有一些輔助提取法如微波輔助[10]、超聲波輔助[11]等提取法試圖提高莜麥多酚的得率[12-13]，但始終無(wú)法避免大量有機(jī)試劑如乙醇的使用，造成了不可避免的環(huán)境污染和能源浪費(fèi)。

近年來(lái)，有研究者將酶法引入植物組分有效成分的提取，并得到廣泛的應(yīng)用[14-16]。與其他方法相比，酶處理方法具有快速、高效、溫和、專一性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且在成本和使用上更加簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備和工藝的要求也較少[17]。然而，迄今為止，使用酶法提取莜麥多酚的研究還非常有限。

以內(nèi)蒙古特產(chǎn)莜麥為原料，基于其多酚大多與多糖及細(xì)胞壁成分以結(jié)合態(tài)的方式存在，本試驗(yàn)擬利用復(fù)合酶(淀粉酶和纖維素酶)，探究酶法提取多酚類物質(zhì)的最佳工藝，旨在為多酚的研究和利用提供依據(jù)，進(jìn)而為內(nèi)蒙古地區(qū)莜麥資源優(yōu)勢(shì)得到充分發(fā)揮，帶動(dòng)地域經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料

莜麥種子：呼和浩特市蒙田種苗有限公司。

沒(méi)食子酸：上海金惠生物科技有限公司；福林酚：上海荔達(dá)生物科技有限公司；纖維素酶：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；α-淀粉酶：無(wú)錫市博立生物制品有限公司；無(wú)水乙醇、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

SQP型萬(wàn)分之一天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；3102型電子分析天平：上海躍平科學(xué)儀器有限公司；UV-7504TC紫外-可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；R20BC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南凱達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確吸取0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于10 mL 容量瓶中，然后加入1 mL Folin-Ciocalteau試劑，搖勻后依次加入2 mL 15%Na2CO3溶液，定容到10 mL，室溫下避光反應(yīng)2 h后于760 nm測(cè)定吸光度。以溶液濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 酶解水溶劑提取莜麥中的酚類物質(zhì)

精確稱取粉碎后的莜麥粉5.00 g加入錐形瓶中，加入不同濃度復(fù)合酶(纖維素酶∶α-淀粉酶 = 1∶1)，在一定pH、溫度、時(shí)間條件下制得多酚提取液。

1.3.3 莜麥中酚類物質(zhì)的測(cè)定

精確移取待測(cè)提取液1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL Folin-Ciocalteu顯色劑，搖勻后加入2 mL15% Na2CO3溶液定容到10 mL，室溫下避光反應(yīng)2 h后，于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚的沒(méi)食子酸當(dāng)量，總酚含量以每克莜麥粉中的沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg)表示[1]。

1.3.4 酶解水溶劑提取酚類物質(zhì)單因素試驗(yàn)

以莜麥多酚得率為依據(jù)，分別對(duì)復(fù)合酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值做單因素試驗(yàn)，以確定各因素的最佳水平。

1.3.5 酶解水溶劑法提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取A(復(fù)合酶用量)、B(酶解時(shí)間)、C(酶解溫度)、D(pH值)4個(gè)因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酚類物質(zhì)的得率為依據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 軟件處理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y=0.124 1x-0.000 6，R2=0.999 7。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酶解水溶劑提取酚類物質(zhì)單因素試驗(yàn)

2.2.1 復(fù)合酶用量對(duì)莜麥多酚得率的影響

圖2中，隨著復(fù)合酶用量增加，多酚含量明顯上升。這是因?yàn)榈矸勖冈谶m宜的介質(zhì)中可以水解莜麥粉中的淀粉，有助于與淀粉結(jié)合的部分多酚釋放；纖維素酶在適宜介質(zhì)中可作用于莜麥麩皮細(xì)胞，將其細(xì)胞壁中的纖維素水解為二聚糖、單糖等小分子，細(xì)胞壁的破裂，減少了莜麥酚類物質(zhì)向溶劑中的擴(kuò)散阻力，從而利于酚類物質(zhì)的浸出。但當(dāng)復(fù)合酶用量超過(guò)0.8%后，酚類物質(zhì)得率變化不大。這是因?yàn)殡S著酶濃度的升高，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，導(dǎo)致酶的作用受到抑制[14]。

圖2 復(fù)合酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH對(duì)莜麥多酚得率的影響

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)莜麥多酚得率的影響

圖2中，隨著酶解時(shí)間的增加，莜麥酚類物質(zhì)得率升高，當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí)，莜麥中多酚物質(zhì)得率最高(2.417 mg/g)；而當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)90 min后，其酚類得率并沒(méi)有明顯提高。這是因?yàn)樵诿附庖欢〞r(shí)間后，細(xì)胞壁與淀粉等形成的阻力被消除，細(xì)胞內(nèi)外的多酚濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)提高溶液中多酚濃度的作用有限[18]。故綜合考慮生產(chǎn)效率及經(jīng)濟(jì)因素，選擇酶解時(shí)間90 min為宜。付曉燕等[19]利用復(fù)合酶(淀粉酶和蛋白酶)輔助提取燕麥多酚時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，以1.5 h左右為宜。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相符。

2.2.3 酶解溫度對(duì)莜麥多酚得率的影響

圖2中，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高，莜麥中酚類物質(zhì)得率隨之升高，在55 ℃時(shí)得率最高。這是因?yàn)椋阂环矫娴矸勖负屠w維素酶酶解活力隨溫度升高而增強(qiáng)，使反應(yīng)速率加快，另一方面，在加熱過(guò)程中，淀粉本身可發(fā)生膨脹并釋放直鏈淀粉，隨著加熱的進(jìn)行，淀粉顆粒破裂，使得多酚物質(zhì)得以從籠形包含物中釋放出來(lái)，因此，多酚得率隨之增加。有研究表明，二者相比，酶解作用是促進(jìn)燕麥粉中多酚釋放的主要原因[20]。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，多酚得率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟瘸掷m(xù)升高，導(dǎo)致酶活力減弱，穩(wěn)定性降低，且高溫還可能會(huì)破壞已提取出來(lái)的多酚結(jié)構(gòu)[11]，故選取55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.4 pH值對(duì)莜麥多酚得率的影響

圖2中，當(dāng)pH值小于5.5時(shí)，莜麥中酚類物質(zhì)得率隨著介質(zhì)pH值增大而顯著提高，當(dāng)酶解液pH達(dá)5.5時(shí)，莜麥中酚類物質(zhì)得率最高，當(dāng)pH值繼續(xù)增大，莜麥多酚得率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)槿芤簆H不僅可以影響酶的活力和組織結(jié)構(gòu)，還可能影響底物的解離狀態(tài)[14]。所以，選取5.5為本試驗(yàn)最佳pH值。

2.3酶解水溶劑法提取莜麥酚類物質(zhì)正交優(yōu)化試驗(yàn)

從表2可以看出，影響莜麥中酚類物質(zhì)得率的4個(gè)因素按影響主次順序?yàn)椋篈>C>D>B，即復(fù)合酶用量>酶解溫度>pH值>酶解時(shí)間；其中最優(yōu)工藝條件的組合為A2B1C2D1，即復(fù)合酶用量0.8%，酶解時(shí)間80 min，酶解溫度55 ℃，pH值5.0。該組合不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，經(jīng)驗(yàn)證：在此條件下得出莜麥中酚類物質(zhì)得率為：2.950 mg/g，其得率大于正交試驗(yàn)中任一組合。付曉燕等[19]利用蛋白酶和淀粉酶提取莜麥多酚，提取含量為2.169 mg/g，低于本試驗(yàn)多酚得率。

表2 L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.4 酶法提取與微波輔助提取法比較

前期對(duì)微波輔助有機(jī)溶劑提取法進(jìn)行了優(yōu)化(微波功率700 W，乙醇濃度50%，提取時(shí)間60 min，提取溫度60 ℃)。本試驗(yàn)比較了這2種方法在最優(yōu)條件下酚類物質(zhì)的得率，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，酶法提取多酚得率顯著高于微波輔助提取法，這可能由于莜麥麩皮中阿魏酸有98%都是以結(jié)合態(tài)形式存在[21]。使用纖維素酶酶解處理莜麥粉，能夠有效酶解麩皮中的纖維素、半纖維素，釋放出其中的結(jié)合態(tài)阿魏酸。同時(shí)，淀粉酶水解可以通過(guò)伸展淀粉鏈破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和水解糖苷鍵，使得被包裹在淀粉顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的單體酚如咖啡酸、香草醛得到有效釋放[20]。結(jié)果表明：酶解水溶劑提取法優(yōu)于微波輔助有機(jī)溶劑提取法。

圖3 酶法提取與微波輔助提取法比較

3 結(jié)論

3.1 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)確定出影響酶解水溶劑提取法提取莜麥中酚類物質(zhì)的各因素順序?yàn)椋簭?fù)合酶用量>酶解溫度>pH值>酶解時(shí)間，其最佳工藝條件為：復(fù)合酶用量0.8%，酶解時(shí)間80 min，酶解溫度55 ℃，pH值5.0，以此條件組合得出莜麥中酚類物質(zhì)的得率為：2.950 mg/g。

3.2 酶解水溶劑法提取莜麥中的酚類物質(zhì)優(yōu)于微波輔助有機(jī)溶劑提取法。

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The Microwave-Assisted Organic Solvent Extraction of Poly-Phenols from Oat

Lü Junli1You Xinyong1Ren Zhilong2Liu Zhongyuan1

(School of Life Science and Technology, Inner Mogolia University of Science and Technology1，Baotou 014010) (School of Food and Drug, Baotou Light Industry Vocational Technical College2, Baotou 014035)

Naked oats is one of the characteristics crops in Inner Mongolia. It has many physiological functions in lowering blood sugar and blood lipid, et al. In order to study the extraction of polyphenols in oat, we used oat from Inner Mongolia as raw material. On the basis of polyphenols yields and single factor experiment, orthogonal experiments have been carried out to optimize the enzymatic extraction. The optimum extraction processes were as follows: 0.8% compound enzyme dosage, enzymolysis time 80 min, enzymolysis temperature 55 ℃, pH 5.0, phenolics extraction yield 2.950 mg/g. When compared with microwave-assisted organic solvent extraction, the extraction yield of polyphenol by enzymatic extraction was significantly higher than that of microwave-assisted extraction, which showed that enzymatic extraction process is better than microwave-assisted organic solvent extraction in terms of extraction of poly-phenols from naked oats.

naked oats, phenolics, enzymatic extraction

TS210.4

A

1003-0174(2017)11-0123-05

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究(NJZY14171)，內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金( 2014BS0312)，內(nèi)蒙古科技大學(xué)創(chuàng)新基金(2014QDL005)

2016-10-25

呂俊麗，女，1982年出生，講師，食品營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)