曹 芳，李海濤，王明明

·藥學(xué)研究·

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測大鼠血漿鹽酸妥布特羅含量及其貼劑藥代動(dòng)力學(xué)的研究

曹 芳，李海濤，王明明*

目的建立測定大鼠血漿中鹽酸妥布特羅濃度的方法，并對鹽酸妥布特羅貼劑藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。方法采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，以克侖特羅為內(nèi)標(biāo)，安捷倫氨基C18分析柱為色譜柱，A(0.1%甲酸+100%水)及B(甲醇)為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。色譜條件為0～2.5 min，70%A→40%A；2.5～2.6 min，40%A→70%A；2.6～5 min，70%A。采用電噴霧電離源和多反應(yīng)監(jiān)測的方式進(jìn)行正電荷檢測，用作定量分析的鹽酸妥布特羅和克侖特羅的離子反應(yīng)對m/z分別為228.2→154.0和277.1→203.0。結(jié)果鹽酸妥布特羅在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；最低檢測限分別為0.5 ng/mL；鹽酸妥布特羅樣本的日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度均符合相關(guān)生物樣品分析的要求，且RSD<10%。鹽酸妥布特羅大鼠血漿樣品在室溫放置7 h、經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)及在-80 ℃中放置120 d等條件下均可保持穩(wěn)定；該方法成功運(yùn)用于鹽酸妥布特羅貼劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)論該方法具有檢測快速且靈敏性好等特點(diǎn)，可對其人體臨床相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究展開探討。

鹽酸妥布特羅；貼劑；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；血藥濃度；藥代動(dòng)力學(xué)

0 引言

鹽酸妥布特羅是一種對支氣管平滑肌具有持久且較強(qiáng)擴(kuò)張作用的第3代選擇性β2受體激動(dòng)劑，主要應(yīng)用于慢性阻塞性肺疾病、哮喘型支氣管炎及慢性支氣管炎等呼吸內(nèi)科疾病的預(yù)防與治療[1-2]。臨床研究表明，鹽酸妥布特羅除具有平喘作用之外，在止咳方面亦具有較好的藥理活性[3-4]。目前臨床針對妥布特羅的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的相關(guān)研究較少，對該藥物貼劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究更是少見[5-6]。針對該問題，本研究利用大鼠模型，建立了一種快速、準(zhǔn)確和靈敏的妥布特羅含量檢測方法，并利用該方法對鹽酸妥布特羅貼劑藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，為后期該藥物在人體臨床藥學(xué)及藥動(dòng)學(xué)研究提供了一定的借鑒。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(LC-20AD型，日本島津公司)；Techne氮吹儀(英國泰科尼公司)；QTRAPTM4000型質(zhì)譜儀(美國Applied AB Sciex公司)；Analyst software 1.5.2分析軟件(美國Applied AB Sciex公司)。

1.2 藥品及試劑 鹽酸妥布特羅標(biāo)準(zhǔn)品(Tulobuterol，中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號(hào)：2015012173)；鹽酸妥布特羅貼劑由中國藥科大學(xué)藥學(xué)院制備并提供，陜西省疾病控制中心藥物分析研究所完成其質(zhì)量控制研究；克侖特羅作為本研究中內(nèi)標(biāo)(美國Sigma公司，純度99.6%，批號(hào)：94330108)；色譜甲醇，甲基叔丁醚及甲酸(美國Sigma公司，批號(hào)：15220171)；其他試劑均為分析純。質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 質(zhì)譜圖及其化學(xué)結(jié)構(gòu)注：A.鹽酸妥布特羅(228.2→154.0)；B.克侖特羅(277.1→203.0)

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：氨基C18分析色譜柱(100 mm×2.1 mm，3 μm，美國安捷倫公司)。流動(dòng)相：A(0.1%甲酸+100%水)，B(甲醇)。色譜條件：0～2.5 min，70%A→40%A；2.5～2.6 min，40%A→70%A。2.6～5 min，70%A。流速：0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：2 μL。進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。

2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，正電荷模式檢測，電噴霧電離源(ESI)。離子噴霧電壓：5 500 V；氣體壓力345 kPa；用于定量的鹽酸妥布特羅及克侖特羅的離子反應(yīng)對m/z分別為228.2→154.0、277.1→203.0；去簇電壓(DP)分別為53、62 V；入口電壓(EP)分別為10、7 V；碰撞能量(CE)分別為25、23 eV；碰撞室出口電壓(CXP)分別為10、12 V。

2.3 對照品溶液的配制 分別用甲醇將鹽酸妥布特羅及內(nèi)標(biāo)克侖特羅配成1.0 ng/mL和100 ng/mL的儲(chǔ)備液，于-80 ℃冰箱中保存。對照品儲(chǔ)備液的制備：將上述1.0 mg/mL的鹽酸妥布特羅用甲醇稀釋配成0.5、2.5、5、10、50、100 ng/mL的儲(chǔ)備液。內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度則為100 ng/mL。

2.4 血漿樣品處理 所有血樣均通過超臨界萃取技術(shù)處理，于4 ℃條件下，取200 μL大鼠血樣并向其中加入20 μL IS，20 μL甲醇，20 μL氨水(1 mol/L)，渦旋混合30 s；加600 μL甲基叔丁醚于上述混合液中，渦旋混合3 min；處理后的上述血漿在4 000 r/min條件下高速離心(1 163 r/min)5 min，吸取上清液500 μL置于干燥離心管中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫自然揮干；取殘留物，加入50 μL甲醇復(fù)溶，并于12 000 r/min條件下高速離心(10 464 r/min)5 min后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5 專屬性考察 在上述色譜及質(zhì)譜條件下，分別得到大鼠空白血漿(圖2A)、對照品血漿(圖2B)及大鼠服藥后3 h血漿(圖2C)的典型多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，見圖2。鹽酸妥布特羅和內(nèi)標(biāo)克侖特羅的保留時(shí)間分別為2.23、1.89 min，液質(zhì)圖峰形良好，血漿中存在的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾上述藥物的檢測。

圖2 色譜圖

注：A.大鼠空白血漿；B.大鼠空白血漿+0.5 ng/mL鹽酸妥布特羅(左)，大鼠空白血漿+內(nèi)標(biāo)溶液(右)；C.大鼠灌胃給予服用鹽酸妥布特羅1 mg后3 h血漿(左)，大鼠灌胃給予服用1 mg克侖

特羅1 mg后3 h血漿(右)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限(LLOQ)的考察 收集不含鹽酸妥布特羅及內(nèi)標(biāo)的大鼠血漿，配置含有鹽酸妥布特羅的對照品血漿，其質(zhì)量濃度分別為0.5、2.5、5、10、50、100 ng/mL，并根據(jù)“2.3”和“2.4”項(xiàng)相關(guān)樣品檢測方法對相關(guān)樣品進(jìn)行測定。以鹽酸妥布特羅峰面積比值(R)為縱坐標(biāo)，以其濃度(c)為橫坐標(biāo)，計(jì)算該藥物在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其直線回歸方程：Y=0.132 4 X+0.267 6 (r=0.996 7)；結(jié)果表明，鹽酸妥布特羅的LLOQ分別為0.5 ng/mL，其在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取大鼠空白血漿，參照“2.3”及“2.4”項(xiàng)下方法，將鹽酸妥布特羅配制成高、中、低濃度梯度QC樣品(即1、20、80 ng/mL)，上述濃度均分別連續(xù)測定3 d，且進(jìn)行6樣本分析。根據(jù)每日所檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中鹽酸妥布特羅的日內(nèi)精密度，并在不同的日期重復(fù)操作，計(jì)算該藥物的日間精密度。見表1。

表1 鹽酸妥布特羅的精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.8 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性檢測 取大鼠空白血漿，參照“2.3”及“2.4”項(xiàng)下方法，將鹽酸妥布特羅配制成濃度為1、20、80 ng/mL的高、中、低濃度梯度樣品，分別取2 μL進(jìn)樣。取上述濃度下對應(yīng)的峰面積，并計(jì)算其提取回收率(n=6)。結(jié)果顯示，低、中、高濃度鹽酸妥布特羅的回收率分別為95.6%±3.3%、93.7%±1.6%、97.4%±4.1%。按照上述操作，另配制100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行回收率檢測，結(jié)果顯示，內(nèi)標(biāo)回收率為92.1%±1.0%。結(jié)果表明，該鹽酸妥布特羅及內(nèi)標(biāo)的回收率均符合要求。

另取大鼠空白血漿，參照“2.3”及“2.4”項(xiàng)下方法，分別加入上述配制的1、20、80 ng/mL鹽酸妥布特羅2 μL及內(nèi)標(biāo)2 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，將上述得到的峰面積分別與直接進(jìn)樣的等濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到的峰面積相比較，對本研究中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，上述濃度的鹽酸妥布特羅基質(zhì)效應(yīng)分別為101.4%±5.5%、112.2%±3.1%、106.4%±2.2%。內(nèi)標(biāo)的平均基質(zhì)效應(yīng)為96.6%。結(jié)果顯示，該鹽酸妥布特羅和內(nèi)標(biāo)在本方法下均不存在基質(zhì)效應(yīng)。

考察不同的保存條件下鹽酸妥布特羅的低、中、高質(zhì)量濃度和內(nèi)標(biāo)(100 ng/mL)血漿樣品的穩(wěn)定性(n=6)，結(jié)果顯示，該藥物及內(nèi)標(biāo)血漿樣品于室溫中放置7 h、3次冷凍-解凍循環(huán)處理及在-80 ℃條件下保存120 d后均穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性檢測結(jié)果(n=6)

2.9 藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 18只雌性SD大鼠(300～350 g)購買于陜西省疾病控制中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2015-1113，由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，日常光照及自由飲水，實(shí)驗(yàn)開始前上述大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

將上述大鼠隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組及低劑量組，對大鼠脖頸背部進(jìn)行剃毛處理，并于實(shí)驗(yàn)日分別將0.5、1.0、2.0 mg鹽酸妥布特羅貼片貼于大鼠脖頸處，貼片面積分別為2.5、5.0、10 cm2，給藥完成后讓大鼠自由活動(dòng)，并于給藥后0、0.5、1、2、2.5、3、5、7、9、12、20、24、48 h通過尾靜脈取血法取0.5 mL大鼠靜脈血，置于肝素管中，冰浴冷卻后離心10 min(5 000 r/min)得到分離后的血漿，置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用LC-MS/MS法檢測給藥后不同時(shí)間的鹽酸妥布特羅血藥濃度，利用DAS 2.1軟件(中國藥學(xué)會(huì))對相關(guān)藥-時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并得到主要藥動(dòng)學(xué)檢測數(shù)據(jù)，見表3。鹽酸妥布特羅藥-時(shí)曲線見圖3。

表3 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)主要參數(shù)(n=6)

圖3 鹽酸妥布特羅藥-時(shí)曲線

3 討論

鹽酸妥布特羅為選擇性β2受體激動(dòng)劑，對支氣管平滑肌具有較好的擴(kuò)張作用，但對心臟的興奮作用較弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，鹽酸妥布特羅松弛支氣管平滑肌的作用為氯喘通的2～10倍，藥效維持時(shí)間為異丙腎上腺素的5～10倍，而對心臟的興奮作用僅為異丙腎上腺素的1/1 000[7-8]。鹽酸妥布特羅貼片為該藥物的重要?jiǎng)┬椭?，其給藥較為持久且不良反應(yīng)較小，因此，妥布特羅貼劑可能成為一種被廣泛應(yīng)用的呼吸內(nèi)科藥物[9]。但臨床針對該藥物貼劑的LC-MS/MS研究十分匱乏。因此，建立簡便且準(zhǔn)確的鹽酸妥布特羅貼劑血藥濃度檢測方法具有十分重要的意義。Matsumura等[10]早在上世紀(jì)80年代已應(yīng)用氣相色譜-電子捕獲檢測器法對兔及人體血漿中妥布特羅的檢測方法展開了初步研究，但由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)限制等因素，其研究深度不夠，且檢測指標(biāo)極為有限。徐福等[11]在上述研究的基礎(chǔ)上，建立了一種兔血漿中鹽酸妥布特羅口服制劑濃度的LC-MS/MS快速檢測方法，盡管該研究是首次利用該方法對鹽酸妥布特羅的含量進(jìn)行檢測，但其未對該藥物的藥代動(dòng)力學(xué)展開深入討論。Kim等[12]對比格犬中鹽酸妥布特羅口服制劑的藥代動(dòng)力學(xué)展開了研究，但其研究對象仍未口服制劑，而未對該藥物的貼劑進(jìn)行研究。

針對上述研究的不足，本研究建立了一種靈敏且高效的LC-MS/MS檢測方法，用于鹽酸妥布特羅貼劑藥代動(dòng)力學(xué)研究，該方法的準(zhǔn)確度、精密度及檢測限均符合相關(guān)要求。盡管本課題得到較為科學(xué)的檢測結(jié)果，但仍存在諸多問題。首先，本研究中藥代動(dòng)力學(xué)研究對象為大鼠，該方法是否適用于人體試驗(yàn)還需要進(jìn)一步探討；此外，本研究使用的鹽酸妥布特羅貼劑為自制，盡管通過相關(guān)檢測對其質(zhì)量進(jìn)行了較好的控制，但由于其缺乏普遍性，所以，在后續(xù)研究中還需選用市場中銷售的相關(guān)藥物對其展開深入論證；最后，由于臨床對鹽酸妥布特羅的代謝產(chǎn)物研究較少，因此，本研究未能對該藥物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時(shí)檢測，在后期研究中應(yīng)對該問題進(jìn)行進(jìn)一步闡述。

綜上所述，本方法可應(yīng)用于鹽酸妥布特羅貼劑的大鼠藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究，為其人體試驗(yàn)奠定一定的基礎(chǔ)，對妥布特羅的應(yīng)用研究具有重要意義。

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SimultaneousdeterminationoftulobuterolinratplasmabyLC-MS/MSanditsapplicationinpharmacokineticstudyoftulobuterolpatch

CAO Fang,LI Hai-tao,WANG Ming-ming*

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an 716000,China)

ObjectiveTo establish a method for simultaneous determination of tulobuterol in rat plasma and study the pharmacokinetics of tulobuterol patch.MethodsAfter plasma sample was treated with protein precipitation combined with extraction,the determination was performed on Angilent Venusil MP C18column with clenbuterol as the internal standard and 0.1% formic acid+100% water (A) and methanol (B) as the mobile phase (0～2.5 min，70%A→40%A；2.5～2.6 min，40%A→70%A；2.6～5 min，70%A).Tulobuterol (228.2→154.0) and clenbuterol (277.1→203.0) were detected by electrospray ionization(ESI)with positive ion in MRM mode quantitatively.ResultsThe linear range was 0.5～100 ng/mL for tulobuterol.The lower limits of quantitation was 0.5 ng/mL.The intra-day and inter-day precision and accuracy were all in line with the requirements of biological sample analysis.The plasma samples were stable after three freeze-thaw cycles and being stored for 7 h at room temperature and 120 days at -80 ℃.ConclusionThe method has the advantages of fast detection and good sensitivity,which can be used to investigate the pharmacokinetics of the human body in clinic.

Tulobuterol;Patch;LC-MS/MS;Plasma concentration;Pharmacokinetics

2017-03-22

延安大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 延安 716000

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711020