周開珩，黃 蕓

人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學(xué)研究

周開珩*，黃 蕓

目的研究人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學(xué)機(jī)制。方法采用PLM腺病毒轉(zhuǎn)染人參皂苷Rb3灌胃后大鼠的心肌細(xì)胞，Western blot檢測(cè)不同環(huán)境下人參皂苷Rb3對(duì)Ser68表達(dá)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶pERK1/2、凋亡抑制蛋白Survivin、MAPK通路p38，以及凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表達(dá)的影響。結(jié)果人參皂苷Rb3在缺氧和低糖環(huán)境下，可降低Ser68磷酸化表達(dá)，提升心臟的收縮供血能力，抑制ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2，緩和pERK1/2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的加速作用。人參皂苷Rb3還可在缺氧環(huán)境下增強(qiáng)凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)。此外，缺氧和低糖環(huán)境下，人參皂苷Rb3可以降低MAPK通路重要蛋白p38的表達(dá)，并抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)，改善心肌梗死。結(jié)論在缺氧和低糖環(huán)境下，人參皂苷Rb3對(duì)心肌梗死具有積極的治療作用。

人參皂苷Rb3；心肌梗死；離子通道調(diào)節(jié)蛋白；pERK1/2；凋亡抑制蛋白

0 引言

人參皂苷Rb3(Ginsenoside Rb3，G-Rb3)是從西洋參莖葉中提取的一種單體皂苷，具有改善神經(jīng)功能缺損、縮小腦內(nèi)梗死面積、緩解腦水腫的作用，還可以通過抗氧化損傷對(duì)各類缺血損傷進(jìn)行保護(hù)[1]。人參皂苷Rb3還具有抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌損傷及抗AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的藥理作用[2-4]。另外，心肌在缺血再灌注過程的代償變化引起心室重構(gòu)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，人參皂苷Rb3可能通過影響心肌梗死不同階段基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維增生，從而對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)有一定的防治作用。本研究主要探討人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～220 g，正常飲食。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rb3，98%純度，白色粉末狀，溶解于氯化鈉注射液中，濾膜濾除菌后使用。

1.3 動(dòng)物分組、模型制備、給藥方法 60只大鼠隨機(jī)平均分成6組?？瞻捉M(Vehicle)：10只，氯化鈉注射液灌胃，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染；缺氧空白組(UN-OD)：10只，空白氯化鈉注射液灌胃，缺氧環(huán)境，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染；低糖空白組(UN-GD)：10只，空白氯化鈉注射液灌胃，低糖環(huán)境，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染；給藥組(G-Rb3)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染；缺氧給藥組(G-Rb3-OD)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，缺氧環(huán)境，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染；低糖給藥組(G-Rb3-GD)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，低糖環(huán)境，PLM腺病毒轉(zhuǎn)染。

1.4 大鼠心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng) 末次給藥后，10只空白組(Vehicle)和10只給藥組(G-Rb3)大鼠腹腔注射肝素鈉1 200 U，15 min后腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，待麻醉后行開胸術(shù)，迅速取出心臟，放入無鈣臺(tái)氏液中，經(jīng)主動(dòng)脈插管，再將心臟連于Langerdoff灌流裝置灌流(37 ℃、95% O2)。先用無鈣臺(tái)氏液灌流，10 min后換成含膠原酶Ⅱ(0.5 mg/mL)和牛血清白蛋白(1 mg/mL)的無鈣臺(tái)氏液灌流，至心臟膨脹變軟變白即停止灌流，取左心室游離壁心肌組織，充分剪碎、攪拌。將心肌細(xì)胞接種在覆蓋有Laminin的玻片上，2 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，去掉不能貼壁的心肌細(xì)胞。按上述心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程，在缺氧(OD)和低葡萄糖(GD)環(huán)境下培養(yǎng)UN-OD、UN-GD、G-Rb3-OD和G-Rb3-GD組大鼠，每組10只。

1.5 PLM腺病毒載體的制備 將全長(zhǎng)PLM-cDNA亞克隆至帶有綠色熒光蛋白(GFP)的pAdTrack-CMV載體質(zhì)粒。PLM-cDNA與pAdTrack-CMV載體質(zhì)粒有相同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HindⅢ和EcoRⅠ，PCR反應(yīng)連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌stb13。將轉(zhuǎn)化菌在含有氨芐青霉素和瘟菌素的LA平皿中克隆，挑取單菌落擴(kuò)增，再行限制性內(nèi)切酶譜分析、PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序鑒定。構(gòu)建成功后，將重組載體(PLM-pAdtract)轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot檢測(cè) PLM腺病毒載體轉(zhuǎn)染72 h后(轉(zhuǎn)染效率約為30%)，收集心肌細(xì)胞，溶解于細(xì)胞裂解液中，并提取總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；封閉液封閉2 h，一抗孵育過夜(4 ℃)，TBST洗滌10 min，連續(xù)洗滌3次，二抗孵育1 h(室溫)，TBST洗滌10 min，連續(xù)洗滌3次；ECL試劑盒顯色，圖像分析軟件(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)定量分析蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 G-Rb3對(duì)PLM磷酸化的影響 人參皂苷Rb3對(duì)Ser68磷酸化的影響不明顯，空白組與給藥組磷酸化Ser68表達(dá)差異不明顯，表達(dá)程度與空白組相當(dāng)。缺氧和低糖環(huán)境下磷酸化Ser68表達(dá)較空白組顯著增強(qiáng)，而人參皂苷Rb3給藥后磷酸化Ser68被有效抑制。見圖1。

圖1 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞PLM磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05;#與UN組比較，P<0.05

2.2 G-Rb3對(duì)ERK1/2磷酸化的影響 磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶pERK1/2的蛋白質(zhì)印跡表征以及人參皂苷Rb3對(duì)心肌細(xì)胞pERK1/2磷酸化的影響如圖2所示，通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達(dá)差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯，且與控制組相當(dāng)。缺氧和低糖環(huán)境下空白組pERK1/2表達(dá)增強(qiáng)，而人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達(dá)有所降低，其影響效果與磷酸化Ser68相似。

圖2 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05;#與UN組比較，P<0.05

2.3 G-Rb3對(duì)Survivin磷酸化、p38、Caspase-3和Caspase-8表達(dá)的影響 凋亡抑制蛋白Survivin蛋白質(zhì)印跡表征人參皂苷Rb3對(duì)心肌細(xì)胞Survivin磷酸化的影響如圖3所示。在正常和低糖環(huán)境中，空白組和人參皂苷Rb3給藥組Survivin幾乎沒有表達(dá)，而在缺氧狀態(tài)下Survivin開始表達(dá)，人參皂苷Rb3給藥組Survivin表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。

P38MAPK是細(xì)胞內(nèi)一種重要的信號(hào)酶，參與多種胞內(nèi)信息傳遞過程，能對(duì)廣泛的細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)。人參皂苷Rb3對(duì)心肌細(xì)胞p38的影響如圖4所示。通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組p38表達(dá)差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯，且與空白組相當(dāng)。缺氧和低糖環(huán)境下空白組p38表達(dá)增強(qiáng)，而人參皂苷Rb3給藥組p38表達(dá)有所降低。

Caspase-3、Caspase-8作為Caspase家族中2個(gè)重要的成員，是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵因子。Caspase-8參與凋亡執(zhí)行，并誘導(dǎo)Caspase-3的激活，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。Caspase-3、Caspase-8在缺氧和低糖環(huán)境下蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而人參皂苷Rb3給藥組可使其表達(dá)降低。見圖5、圖6。

圖3 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞Survivin磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05

圖4 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞p38蛋白表達(dá)的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

圖5 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

圖6 G-Rb3對(duì)心肌細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

3 討論

2000年Sweadner等[5]首次描述了一組離子通道調(diào)節(jié)蛋白，該組蛋白因N末端都含有PFXYD序列而命名為FXYD蛋白。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的此類蛋白共有12種，F(xiàn)XYD蛋白主要分布在調(diào)節(jié)溶質(zhì)和體液的組織器官中，如腎臟、腸道、乳腺、胰腺、肝臟，也分布在具有電活動(dòng)特性的組織器官中，如心肌、骨骼肌、腦。組成FXYD蛋白的氨基酸中至少含有1個(gè)絲氨酸或蘇氨酸，表明FXYD蛋白具有潛在的磷酸化位點(diǎn)。Phospholemman(PLM)，即FXYD1，是由72個(gè)氨基酸組成的跨膜磷酸蛋白[6]，其膜外N末端含有17個(gè)氨基酸，膜內(nèi)C末端含有35個(gè)氨基酸，跨膜片段含有20個(gè)氨基酸，而PFXYD序列位于膜外8～12號(hào)位上。PLM廣泛分布在心肌細(xì)胞膜上，是心肌細(xì)胞主要的磷酸化底物，其膜內(nèi)C末端含有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即62、63、68號(hào)位絲氨酸(Ser62/Ser63/Ser68)和69號(hào)位蘇氨酸(Thr69)[7]。PLM可以被β腎上腺素受體激動(dòng)劑磷酸化[8-10]，同時(shí)，它可以調(diào)節(jié)參與心肌興奮收縮偶聯(lián)的多個(gè)離子通道，使得其可能成為治療心臟疾病的一個(gè)分子靶點(diǎn)[11-15]，目前人參皂苷Rb3對(duì)PLM過表達(dá)的研究還未見報(bào)道。

本文采用PLM腺病毒轉(zhuǎn)染人參皂苷Rb3灌胃后大鼠的心肌細(xì)胞作為模型[16-17]，用Western blot法檢測(cè)不同環(huán)境下人參皂苷Rb3對(duì)Ser68、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2、凋亡抑制蛋白Survivin、MAPK通路p38及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8表達(dá)的影響狀況。

研究發(fā)現(xiàn)，PLM可與心肌細(xì)胞膜上鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase,NKA)相連并調(diào)節(jié)其動(dòng)力學(xué)特性，表現(xiàn)為：PLM通過降低細(xì)胞內(nèi)Na+與NKA親和力來抑制NKA，使細(xì)胞內(nèi)Na+濃度增加，鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger,NCX)前向轉(zhuǎn)運(yùn)(Ca2+外流)減弱而逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(Ca2+內(nèi)流)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，心肌細(xì)胞收縮力增強(qiáng)。而Ser68磷酸化可使PLM與NKA分離，從而解除PLM對(duì)NKA的抑制作用。

PLM對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)受生理環(huán)境和各種藥物的影響。通常環(huán)境下人參皂苷Rb3影響Ser68磷酸化效果不明顯，空白組與給藥組磷酸化Ser68表達(dá)差異不明顯。缺氧和低糖環(huán)境下空白組磷酸化Ser68表達(dá)顯著增強(qiáng)，使PLM對(duì)NKA的抑制減弱，NKA活性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度降低，NCX前向轉(zhuǎn)運(yùn)(Ca2+外流)增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度減少，心肌細(xì)胞收縮力減弱。而人參皂苷Rb3給藥后磷酸化Ser68被有效抑制，可提升心臟的收縮供血能力。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2是一種重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子。當(dāng)ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2時(shí)，抗凋亡活性蛋白失去ERK1/2的磷酸化激活而活性降低,從而加速凋亡過程的發(fā)生。通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達(dá)差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯。缺氧和低糖環(huán)境下空白組pERK1/2表達(dá)增強(qiáng)，使得心肌細(xì)胞加速凋亡。而人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達(dá)有所降低，一定程度上可減緩細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。因此，人參皂苷Rb3是在惡劣的條件下應(yīng)對(duì)心肌壞死的有效藥物。

另一種激素蛋白，凋亡抑制蛋白Survivin，起到和pERK1/2相反的效果。具有非常重要的抗凋亡作用。在正常和低糖環(huán)境中，空白組和人參皂苷Rb3給藥組Survivin幾乎沒有表達(dá)，而在缺氧狀態(tài)下Survivin發(fā)揮抗凋亡作用，人參皂苷Rb3給藥組Survivin表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，說明人參皂苷Rb3對(duì)缺氧引起的心臟病有積極的治療作用。有研究認(rèn)為，在各種應(yīng)激因素作用下，p38參與心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺氧和低糖狀態(tài)下，p38開始高表達(dá)，人參皂苷Rb3給藥組可以抑制其表達(dá)水平。另外，在缺氧和低糖狀態(tài)下，Caspase-3和Caspase-8開始高表達(dá)，人參皂苷Rb3給藥組可以顯著降低缺氧及低糖誘導(dǎo)的Caspase-3和Caspase-8活性升高。

綜上所述，人參皂苷Rb3在缺氧和低糖環(huán)境下，可降低Ser68磷酸化表達(dá)，提升心臟的收縮供血能力；并抑制ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2，緩和pERK1/2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的加速作用。人參皂苷Rb3還可以在缺氧環(huán)境下增強(qiáng)凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，顯著抑制缺氧及低糖誘導(dǎo)的p38、Caspase-3和Caspase-8活性升高，保護(hù)心肌細(xì)胞。以上結(jié)果表明，人參皂苷Rb3對(duì)心肌梗死具有積極的治療作用。然而，由于條件所限，本研究?jī)H通過Western blot法對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，方法單一，后續(xù)需進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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MolecularbiologicalmechanismofginsenosideRb3inthetreatmentofmyocardialinfarction

ZHOU Kai-heng1*,HUANG Yun

(Department of Pharmacy,Ningbo City Medical Treatment Center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China)

ObjectiveTo explore the molecular biological mechanism of ginsenoside Rb3 in the treatment of myocardial infarction.MethodsThe cardiac muscle cells from rats with intragastric administration of ginsenoside Rb3 were cultured in different environments and then transfected by PLM-pAdtract.Western blot was used to detect the effects of ginsenoside Rb3 on the expression of Ser68,the extracellular regulated protein kinase pERK1/2,Survivin,p38,Caspase-3 and Caspase-8 in different environments.ResultsGinsenoside Rb3 in the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions could reduce the expression of phosphorylated Ser68,improve cardiac systolic blood capacity,inhibit ERK1/2 phosphorylation into pERK1/2,relax the acceleration of pERK1/2 on myocardial cell apoptosis.Ginsenoside Rb3 could also enhance the expression of apoptosis inhibitory protein Survivin in the oxygen deprivation condition.In addition,in the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions,ginsenoside Rb3 could reduce the expression of the important protein p38 in MAPK pathway,inhibit the expression of apoptotic proteins Caspase-3 and Caspase-8,and improve myocardial infarction.ConclusionIn the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions,ginsenoside Rb3 has a positive therapeutic effect on myocardial infarction.

Ginsenoside Rb3;Myocardical infarction;PLM;pERK1/2;Survivin

2017-04-08

寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315040

寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃(2016A31)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711002