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(長江師范學院生命科學與技術學院,重慶 408100)

胭脂蘿卜天竺葵素抑制人胃癌細胞遷移與侵襲

梁姍,蔣子川,馮均,龔郭超

(長江師范學院生命科學與技術學院,重慶 408100)

主要探討胭脂蘿卜天竺葵素對人胃癌細胞(MKN45)遷移侵襲能力的影響及機制。采用不同濃度的天竺葵素處理MKN45細胞,用MTT法、流式細胞術、細胞劃痕實驗和TranswellTM小室實驗分別檢測細胞增殖、周期、遷移和侵襲能力變化,并用蛋白印跡法檢測細胞黏附蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達。結果表明,6 μg/mL天竺葵素能顯著抑制細胞的增殖,遷移和侵襲,并使細胞阻滯在S期。天竺葵素抑制細胞遷移和侵襲的機制可能是促進E-cadherin蛋白的表達和抑制N-cadherin蛋白的表達。

天竺葵素,胭脂蘿卜,胃癌,遷移和侵襲

胃癌是全球常見的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)胃癌病例近100萬,約40%發(fā)生在中國,每年因胃癌死亡的人數約80萬,中國約占35%[1]。胃癌主要起源于胃粘膜上皮細胞,胃癌細胞具有很強的遷移侵襲能力,抑制胃癌細胞的遷移與侵襲是抑制胃癌轉移及進行藥物靶向治療的關鍵?；ㄇ嗨?Anthocyanin)又名花色苷,主要糖苷形式存在,是一類廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。迄今為止,人類發(fā)現的天然花青素單體約有20種,其中6種單體較為常見,分別為矢車菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)、飛燕草素(delphindin)、芍藥素素(peonidin)、牽?；ㄋ?petunidin)和錦葵花素(malvidin),各單體的抗氧化、抗炎功能一直是主要的研究熱點[2]。近年來發(fā)現,花青素還具有一定的抗腫瘤活性,且每種花青素單體的活性有一定差異[3-5]。藍莓天竺葵素能通過抑制肺癌細胞內磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/Akt)來抑制人基質金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的表達,從而抑制癌細胞的侵襲[6-7]。紅心蘿卜天竺葵素對乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)具有高親和力,表現出BCRP抑制劑特性[8]。葡萄天竺葵素對胃癌細胞AGS、結腸癌細胞HCT-116、肺癌細胞NCIH460和乳腺癌細胞MCF-7以及非小細胞肺癌HC1299均有一定抑制作用[8-11]。藍莓天竺葵素能提高肝癌細胞HepG2和結腸癌細胞LS174T的抗氧化能力[12]。

胭脂蘿卜(Carmine radish)產于重慶涪陵,為十字花科蘿卜屬一年生草本植物,葉柄、表皮和肉質均呈紫紅色,較易種植,適宜加工,多用于制備食用紅色素。前期我們通過液相色譜分析發(fā)現胭脂蘿卜紅色素主要成分為天竺葵素,占其總含量的95%。目前胭脂蘿卜天竺葵素的生物活性尚未見報道。本研究主要探討胭脂蘿卜天竺葵素對人胃癌MKN45細胞遷移侵襲的影響及作用機制,明確其是否像其它類型花青素一樣具有一定的抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

天竺葵素分離自胭脂蘿卜 純度>95%，長江師范學院天然產物研究實驗室;MKN45細胞為人胃癌細胞株 美國ATCC細胞庫;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、胰蛋白酶(≥180 U)、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、RNA酶(≥250 U) Sigma公司;ECL顯影液 Millipore公司;蛋白Marker、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS) TaKaRa公司;PVDF膜、Tris-HCl(pH6.8、8.8)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液、ACR(丙烯酸脂共聚物)溶液、熒光定量PCR試劑、結晶紫 Bio-Rad公司;RPMI1640培養(yǎng)基;磺化丙啶 Hyclone公司;RNA提取及反轉錄試劑盒 TaKaRa公司;MTT試劑盒(C0009)、兔抗E-cadherin(380654)及N-cadherin抗體(380671)、兔抗GAPDH(380626)、辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔二抗(511201) 正能生物公司;其他化學試劑均為國產分析純。

Optima MAX-XP冷凍超速離心機 德國Beckman公司;FACSCalibur流式細胞分析儀 美國BD公司;GelDoc XR+凝膠成像系統、PowerPac Basic 1645070電泳儀、Trans-Blot SD半干轉儀、CFX96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司;HERAcell 2401二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;TS100相差倒置顯微鏡 日本Nikon公司;HR40-IIA2生物安全柜 中國海爾公司;UPT超純水制造機 中國優(yōu)普公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌MKN45細胞采用含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中細胞覆蓋率達到80%～90%時進行傳代,把原有培養(yǎng)基吸掉,用0.25%胰蛋白酶消化5 min,細胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化,用移液槍吹打細胞,讓細胞懸浮起來,把細胞吸到15 mL的離心管中,1000 r/min離心5 min,按1∶3傳代,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后繼續(xù)傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 根據碧云天公司細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(C0009)說明書進行操作:在96孔板中,每孔加入100 μL 2000個MKN45細胞,于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。對照組加入0.1% DMSO,實驗組用不同濃度的天竺葵素(2、4、6、8 μg/mL),分別處理細胞24、48、72 h后,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),在細胞培養(yǎng)箱內孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan溶解液使外源性MTT還原為水不溶性的紫色結晶。在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h左右至紫色結晶全部溶解。用酶標儀在570 nm測定吸光度(A值),實驗重復3次,每次設3個平行樣。

1.2.3 細胞遷移劃痕實驗 將MKN45細胞以5×105個/mL密度接種于6孔板,培養(yǎng)至100%覆蓋率時,去除培養(yǎng)液,沿6孔板中間劃痕,PBS清洗2次后,加入含2、4、6、8 μg/mL天竺葵素的培養(yǎng)基,對照組加入含0.1% DMSO的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24、48 h后,任取5個視野,20倍顯微鏡下拍照并計數越過劃痕的細胞數目,實驗重復3次,每次設3個平行樣。

1.2.4 細胞侵襲小室實驗 在24孔板中加入含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,將TranswellTM小室置于24孔板中,取5×104個 MKN45細胞分別用含0.1% DMSO及2、4、6、8 μg/mL天竺葵素的培養(yǎng)基培養(yǎng)于小室內。24 h后,吸去小室內培養(yǎng)基,PBS清洗1次后,甲醇固定小室15 min,0.1%結晶紫染色小室內外部15 min,PBS清洗2次后,用棉簽擦掉小室內部,20倍顯微鏡下隨機挑選5個視野拍照小室外部,最后計數細胞個數,統計處理組細胞數與對照細胞數的倍數,實驗重復3次,每次設3個平行樣[5]。

1.2.5 Real-time PCR法檢測不同濃度處理組細胞E-cadherin和N-cadherin的mRNA表達 6孔板細胞長至覆蓋率為80%～90%時,用0.1% DMSO及2、4、6、8 μg/mL天竺葵素處理細胞24 h后,吸去培養(yǎng)基,PBS清洗一次,胰蛋白酶消化并收集各組細胞[10]。用TaKaRa公司試劑盒提取細胞總RNA,再采用TaKaRa公司反轉錄試劑盒方法將RNA轉錄為cDNA。GAPDH上游引物為5′-TGGACTCCACG ACGTACTCA-3′,下游引物為5′-AATCCCATCAC CATCTTCCA-3′;E-cadherin上游引物為5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′,下游引物為5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′;N-cadherin上游引物為5′-TGGGAAATGGAAACTTGATGGC-3′,下游引物為5′-TGGAAAGCTTCTCACGGCAT-3′。用CFX96和Fast EvaGreen Supermix進行實時定量檢測,反應體系為10 μL:Supermix 5 μL,10 μmol/L上游引物0.5 μL,10 μmol/L下游引物0.5 μL,稀釋的cDNA 4 μL,用二步PCR法檢測目的基因表達,基因表達量計算采用ΔΔCt法,實驗重復3次,每次設3個平行樣。

1.2.6 蛋白印跡法(Western blot)檢測細胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 在6孔板中,至細胞長至覆蓋率為80%～90%時,用0.1% DMSO及2、4、6、8 μg/mL天竺葵素處理細胞24 h后,吸去培養(yǎng)基,PBS清洗一次,胰蛋白酶消化并收集各組細胞。用EBC250裂解細胞,595 nm波長測量蛋白含量,95 ℃變性5 min。將50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,200 V恒壓電泳至溴酚藍剛好至凝膠底部,取出凝膠100 V轉膜1.5 h。將PVDF膜分別放入兔抗E-cadhein抗體(1∶1000)、兔抗N-cadhein抗體(1∶1000)、兔抗GAPDH抗體(1∶2000),室溫孵育2～3 h;TBST洗滌3次,每次10 min,將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h后TBST洗滌3次,每次10 min。將ECL溶液Ⅰ和Ⅱ等體積混合后,均勻滴加在PVDF膜,將膜放置在凝膠成像儀中進行曝光,選取合適信號強度的照片分析。

1.2.7 流式細胞術分析細胞周期 經過0.1% DMSO和0.6 μg/mL天竺葵素處理24 h的細胞用胰蛋白酶消化[14],收集細胞,用預冷的PBS清洗1次,加入70%乙醇冰上固定30 min后,用500 μL PI染液(包含50 μg/mL磺化丙啶及100 μg/mL RNA酶),37 ℃染色30 min。分析時總共收集20000個細胞進行細胞周期分析,收集完成后,用流式細胞儀(BD FACSCalibur)軟件分析細胞周期。

1.3統計學處理

實驗重復3次,所有實驗數據以“平均數±標準差”表示,應用SPASS 22.0統計軟件對資料進行分析,兩組均數間比較采用方差分析,p<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1天竺葵素抑制MKN45細胞增殖

由MTT結果顯示(表1),2 μg/mL天竺葵素對MKN45細胞增殖無顯著影響,隨著天竺葵素濃度從4 μg/mL上升至8 μg/mL,MKN45細胞增殖受到顯著抑制(p<0.05),6 μg/mL與8 μg/mL天竺葵素對細胞增殖的影響差異不顯著,說明6 μg mL天竺葵素對細胞增殖有較顯著的抑制效果。

表1 天竺葵素對MKN45細胞增殖的影響

注:*表示與對照組相比p<0.05;#表示與24 h同劑量組相比p<0.05;Δ表示與48 h同劑量組相比p<0.05。

2.2天竺葵素抑制MKN45細胞遷移

細胞劃痕實驗結果顯示(表2),在24 h與48 h時，與對照組相比,4、6、8 μg/mL天竺葵素的處理組隨著濃度增大,細胞遷移能力逐漸下降(p<0.05),且6 μg/mL與8 μg/mL處理組之間差異不顯著,說明6 μg/mL天竺葵素即能顯著抑制MKN45細胞遷移能力(p<0.05),2 μg/mL天竺葵素對細胞遷移能力抑制不顯著。

表2 天竺葵素對MKN45細胞遷移的影響

注:*表示與對照組相比p<0.05;#表示與處理組0 h相比p<0.05;Δ表示與處理組24 h相比p<0.05。

2.3天竺葵素抑制MKN45細胞侵襲

TranswellTM小室侵襲實驗結果顯示(圖1),24 h后,與對照組相比,2、4、6、8 μg/mL處理組細胞在侵襲小室中殘留的細胞更少,說明天竺葵素抑制了細胞的侵襲。經統計(圖2),2 μg/mL處理組與對照組差異不顯著,4、6、8 μg/mL的天竺葵素均顯著抑制了細胞的侵襲(p<0.05),6 μg/mL與8 μg/mL處理組的抑制能力差異不顯著,說明6 μg/mL天竺葵素對細胞侵襲已有較顯著的抑制效果。

圖1 天竺葵素對MKN45細胞侵襲能力的影響

圖2 天竺葵素對MKN45細胞侵襲的統計分析

2.4天竺葵素對N-cadherin和E-cadherin表達的影響

N-cadherin與E-cadherin蛋白是鈣依賴性的跨膜蛋白,分布于上皮細胞,主要參與細胞與細胞間黏附,在維持細胞的極性和完整性等方面起重要的作用[13-14]。癌細胞的遷移侵襲通常伴隨著細胞間粘附下降。本研究通過蛋白印跡分析和熒光定量PCR(圖3和表3),發(fā)現與對照組相比,以不同濃度天竺葵素處理24 h后,2 μg/mL天竺葵素處理組的N-cadherin和E-cadherin蛋白和mRNA表達水平與對照組相比表達無顯著差異;4、6、8 μg/mL天竺葵素處理組與對照組相比其E-cadherin蛋白和mRNA的表達水平均下調、N-cadherin蛋白和mRNA的表達平均上調(p<0.05),6 μg/mL與8 μg/mL處理組結果不顯著,說明6 μg/mL能顯著抑制E-cadherin、N-cadherin蛋白和mRNA的表達(p<0.05),提示天竺葵素抑制MKN45的遷移和侵襲與N-cadherin和E-cadherin表達密切相關。

圖3 天竺葵素對N-cadherin和E-cadherin蛋白表達的影響

表3 天竺葵素對N-cadherin和E-cadherin mRNA表達的影響(倍數±s)

注:*表示與對照組相比p<0.05;#表示與2 μg/mL劑量組比p<0.05;Δ表示與4 μg/mL劑量組比p<0.05。

2.5流式細胞術分析細胞周期

為進一步研究天竺葵素影響細胞遷移和侵襲與細胞周期是否相關,采用流式細胞術分析天竺葵素對MKN45細胞周期變化。由圖4可見,經24 h處理后,6 μg/mL天竺葵素對細胞G0期無影響,說明細胞并未凋亡,而G1期顯著上升(p<0.05),S期顯著下降(p<0.05),G2期顯著下降(p<0.05)。說明天竺葵素對細胞造成S期阻滯,抑制了細胞的增殖,與MTT結果相符。

圖4 天竺葵素對MKN45細胞周期的影響

3 結論

通過MTT實驗和流式細胞術分析周期分析發(fā)現,6 μg/mL天竺葵素能使細胞增殖阻滯在S期從而抑制細胞增殖。通過細胞侵襲及劃痕實驗發(fā)現,6 μg/mL天竺葵素能顯著抑制細胞的遷移和侵襲,進一步通過熒光定量PCR以及蛋白印跡實驗表明,其對細胞遷移和侵襲的機制可能是在蛋白和基因水平上抑制N-cadherin以及上調N-cadherin表達。鈣粘蛋白(Cadherin)是一種同親型結合的細胞粘著糖蛋白,對胚胎發(fā)育的細胞識別、遷移和組織分化以及成體組織器官構成具有重要作用。E-cadherin表達的缺失以及N-cadherin表達的增強降低了細胞間的黏附強度,導致細胞活動性增加,促進腫瘤細胞的遷移和侵襲,免疫組化結果表示胃癌侵潤樣本的E-cadherin表達通常下調、N-cadherin表達為上調[15-16],對胃癌細胞株SCG-7901、MKN28的研究中也得出相同結果[17-18]。天竺葵素是否能抑制胃癌轉移,與E-cadherin和N-cadherin在腫瘤樣本的表達是否相關,還需進一步采用體內小鼠模型驗證。

研究發(fā)現胭脂蘿卜天竺葵素能抑制胃癌細胞的遷移、侵襲、增殖,但不影響細胞凋亡,補充了天竺葵素抗腫瘤作用的可能機制。

[1]左婷婷,鄭榮壽,曾紅梅,等.中國胃癌流行病學現狀[J]. 中國腫瘤臨床,2017,44(1):52-59.

[2]陳小捷,陰文婭.植物中花青素提取方法探究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(2):395-399.

[3]Murthy K N C,Sultanpur C M,Rao R M,et a1.Natural molecules as tumourinhibitors:Promises and prospects[J].Journal of Herbal Medicine,2014,4(4):175-187.

[4]許勝,屈達才,黃慧明,等.花色素及其花色苷單體抗腫瘤活性研究進展[J].食品工業(yè)科技,2016,37(14):379-384.

[5]Novotny J A,Clevidence B A,Kurilich A C. Anthocyanin kinetics are dependent on anthocyanin structure[J]. British Journal of Nutrition,2012,107(4):504-509.

[6]Huang Huipei,Shih Y W,Chang Y C,et al. Chemoinhibitory effect of mulberry anthocyanins on melanoma metastasis involved in the Ras/PI3K pathway[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(19):9286-9293.

[7]Shin D Y,LU Jingnan,Kim G Y,et al. Anti-invasive activities of anthocyanins through modulation of tight junctions and suppression of matrix metalloproteinase activities in HCT-116 human colon carcinoma cells[J]. Oncology Reports,2011,25(2):567-572.

[8]Wang L S,Sun X D,Cao Y,et al. Antioxidant and pro-oxidant properties of acylated pelargonidin derivatives extracted from red radish[J]. Food & Chemical Toxicology,2010,48(10):2712-2718.

[9]Kausar H,Jeyabalan J,Aqil F,et al. Berry anthocyanidins synergistically suppress growth and invasive potential of human non-small-cell lung cancer cells.[J]. Cancer Letters,2012,325(1):54-62.

[10]Yun J W,Lee W S,Kim M J,et al. Characterization of a profile of the anthocyanins isolated from Vitis coignetiae Pulliat and their antiinvasive activity on HT-29 human colon cancer cells[J]. Food and Chemical Toxicology,2010,48(3):903-909.

[11]Zhang Y. Human tumor cell growth inhibition by nontoxic anthocyanidins,the pigments in fruits and vegetables.[J]. Life Sciences,2005,76(76):1465-1472.

[12]Kamenickova A,Anzenbacherova E,Pavek P,et al. Pelargonidin activates the AhR and induces CYP1A1 in primary human hepatocytes and human cancer cell lines HepG2 and LS174T[J]. Toxicology Letters,2013,218(3):253-259.

[13]Ferraz M A,Zabaglia L M,Pereira W N,et al. Downregulated Expression of E-cadherin and TP53 in Patients with Gastric Diseases:The Involvement of H. pylori Infection and Its Virulence Markers[J]. Journal of Gastrointestinal Cancer,2016,47(1):20-26.

[14]Rai H C,Ahmed J. A Role of N-Cadherin in Tumor Progression and Prognosis of Epitheliual Malignancy[J]. 2016,3(1):2393-2915.

[15]盧昕,孟慶彬,邵永勝. CDH17對胃癌細胞侵襲性的影響及其機制[J]. 中國普通外科雜志,2015,24(10):1406-1410.

[16]湯光華. 胃癌中Slug和E-cadherin表達及其臨床意義[J]. 武漢大學學報,2015,36(4):536-540.

[17]Xia R,Jin F Y,Lu K,et al. SUZ12 promotes gastric cancer cell proliferation and metastasis by regulating KLF2 and E-cadherin[J]. Tumor Biology,2015,36(7):5341-5351.

[18]Jiang S B,He X J,Xia Y J,et al. MicroRNA-145-5p inhibits gastric cancer invasiveness through targeting N-cadherin and ZEB2 to suppress epithelial-mesenchymal transition[J]. Oncotargets & Therapy,2016,9:2305-2315.

Pelargoniumfromcarmineradishinhibitsmigrationandinvasionofhumangastriccancer

LIANGShan,JIANGZi-chuan,FENGJun,GONGGuo-chao

(Life Science and Technology Institute,Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

The mechanisms of carmine radish pelargonium inhabited gastric cancer cells(MKN45)migration and invasion was investigated in the study. After different concentrations of pelargonium treatment,MTT assay,flow cytometry(FCM),cell wound healing and TranswellTMassay were used to detect the cell proliferation,cell cycle,cell migration and invasion ability. Protein expression of E-cadherin and N-cadherin were measured with western blot. The results showed 6 μg/mL pelargonium inhibited MKN45 cell proliferation,migration and invasion remarkable,induced cell S phase arrest. E-cadherin upregulation and N-cadherin downregulation might be the major mechanisms of pelargonium inhibited cell migration and invasion.

pelargonium;carmine radish;gastric cancer;migration and invasion

2017-04-05

梁姍(1982-),女,博士,講師,研究方向:天然產物分離及活性研究,E-mail:vmm420@hotmail.com。

重慶市教委科研基金(KJ1601207);長江師范學院校級科研項目(2015KYQD01)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)22-0001-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.001