陳繼兵，黃建都，林峰，林翮飛，林文

（福建福州市蔬菜科學(xué)研究所，350111）

閩茄5號(hào)及其近緣新組合的SRAP鑒定

陳繼兵，黃建都，林峰，林翮飛，林文

（福建福州市蔬菜科學(xué)研究所，350111）

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)閩茄5號(hào)及其親本材料、新組合（06-29×06-16）及其親本材料的DNA特異型條帶進(jìn)行分析研究，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，從100對(duì)引物組合中篩選出1對(duì)引物（Em2/Me5）能擴(kuò)增出閩茄5號(hào)及其父本的多態(tài)性條帶；1對(duì)引物（Em3/Me3）能擴(kuò)增出新組合（06-29×06-16）及其父本的多態(tài)性條帶。說明該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于茄子近緣品種間的檢測。

閩茄5號(hào)；茄子；SRAP；分子標(biāo)記

茄子（Solanum melongenaL.）為茄科茄屬植物，是世界上熱帶和溫帶地區(qū)重要的蔬菜，含有多種維生素、脂肪、糖以及礦物質(zhì)等，特別是富含維生素P，具有許多藥用價(jià)值，是一種很好的保健蔬菜。閩茄5號(hào)是福州市蔬菜科學(xué)研究所選育的優(yōu)良茄子新品種，其母本為中晚熟類型06-29，父本為中熟類型06-13。閩茄5號(hào)屬中熟類型，較耐低溫弱光，始花節(jié)位10～11節(jié)，果形直，果色紫紅，果肉白，抗病性強(qiáng)[1]。2015年通過福建省非主要農(nóng)作物認(rèn)定，已在生產(chǎn)上大面積推廣。新組合（06-29×06-16）的母本與閩茄5號(hào)相同，父本為早熟類型06-16，在制種時(shí)容易發(fā)生混雜。種子純度是種子質(zhì)量的重要內(nèi)容，也是農(nóng)民增收的重要保證。因此，試驗(yàn)以閩茄5號(hào)及其親本和新組合（06-29×06-16）及其親本作為材料，通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，建立閩茄5號(hào)及新組合（06-29×06-16）DNA指紋圖譜，在提高種子質(zhì)量、純度檢測及生產(chǎn)推廣方面提供科學(xué)依據(jù)。

表1 SRAP引物序列

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

閩茄5號(hào)及其父本1、新組合（06-29×06-16）及其父本2和共同的母本均由福州市蔬菜科學(xué)研究所茄子課題組提供。采用穴盤育苗，待幼苗長到2～3片真葉時(shí)取嫩葉提取DNA備用。SRAP引物參照Li等[2]的報(bào)道進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。dNTPs、Taq DNA酶、Buffer等由博彩公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

①茄子DNA提取隨機(jī)選取各樣本10株，剪取剛展開的新鮮茄子嫩葉20 g，放至液氮中研磨。采用改良的CTAB法提取茄子總DNA[3]，利用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測定OD值，檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和濃度，使用時(shí)將DNA稀釋到40 ng/L。

②SSRAP擴(kuò)增選擇10條上游引物和10條下游引物，隨機(jī)配成100對(duì)引物組合。25 μL反應(yīng)體系為：30 ng/μL DNA模板，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L引物，0.75 U Taq酶。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

③PCR產(chǎn)物的檢測采用1%的瓊脂糖凝膠，恒壓120 V電泳35 min。使用EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照保存。

圖1 引物Me5/Em2閩茄5號(hào)及其父母本基因組DNA的SRAP擴(kuò)增

圖2 引物Me3/Em3新組合及其父母本基因組DNA的SRAP擴(kuò)增

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選

利用10條上游引物（Me1～Me10）和10條下游引物（Em1～Em10）組成的100對(duì)引物組合對(duì)供試材料的混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增篩選。結(jié)果表明，大部分SRAP引物均能在250～2 000 bp擴(kuò)增出條帶。選擇條帶清晰并且條帶數(shù)目較多的引物組合對(duì)閩茄5號(hào)、新組合（06-29×06-16）及各自親本材料進(jìn)行SRAP擴(kuò)增。篩選出1對(duì)引物組合（Me5/Em2）擴(kuò)增的閩茄5號(hào)譜帶表現(xiàn)為偏父型；1對(duì)引物組合（Me3/Em3）擴(kuò)增的新組合（06-29×06-16）譜帶表現(xiàn)為偏父型。

2.2 指紋圖譜的建立

利用篩選出的具有特異性譜帶的引物進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，引物組合Me5/Em2對(duì)閩茄5號(hào)擴(kuò)增在1 200 bp具有偏父性條帶（圖1）；引物組合Me3/Em3對(duì)新組合（06-29×06-16）擴(kuò)增在460 bp具有偏父性條帶（圖2）。2對(duì)引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物具有高度穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)閩茄5號(hào)及新組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，篩選出Me5/Em2和Me3/Em3分別對(duì)閩茄5號(hào)及新組合建立指紋圖譜，可以將閩茄5號(hào)及新組合很好地區(qū)分開。

SRAP標(biāo)記是顯性標(biāo)記，并且符合孟德爾遺傳規(guī)律，親本所具有的特異性帶能在雜交F1代的譜帶中表現(xiàn)出來[4]，因此，通過檢測F1代帶中是否出現(xiàn)雙親的特異性帶，可以對(duì)不同品種進(jìn)行鑒定。在新品種選育過程中，一些優(yōu)勢較強(qiáng)的自交系往往作為母本被重復(fù)利用，因而選育出的新組合與原品種之間具有較高的同源性，用分子標(biāo)記檢測種子純度時(shí)不能選擇母本的特異型條帶，而應(yīng)以父本的特異型帶進(jìn)行篩選。在制種前也可以利用此圖譜作為父本除雜的依據(jù)，提高種子質(zhì)量。

[1]陳繼兵，林峰，林文.茄子新品種閩茄5號(hào)的選育[J].中國蔬菜，2012（24）：99-100.

[2]Li G,Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103:455-461.

[3]王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002：742-744.

[4]郭修武，張鵬翔，郭印山，等.應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定葡萄種間雜交后代[J].分子植物育種，2011（9）：1 389-1 393.

Identification of Minqie No.5 and Its Related New Combination by SRAP Marker

CHEN Jibing,HUANG Jiandu,LIN Feng,LI Hefei,LIN Wen

(Fuzhou Institute of Vegetable Sciences,Fujian 350111)

Using SRAP molecular markers technology,the characteristic polymorphic bands of Minqie No.5,new combination and their parents were analyzed.After repeated experiments,2 pairs of primers were screened out from 100 primer pairs.A pair of primers(Em2/Me5)could amplify Minqie No.5 and its farther characteristic polymorphic band,and a pair of primers(Em3/Me3)could amplify new combination and its farther characteristic polymorphic band.SRAP could be a rapid and reliable method to test the close relative of eggplants.

Minqie No.5;Eggplant;SRAP;Molecular marker

S641.1

A

1001-3547（2017）20-0050-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.20.018

福建省科技重大專項(xiàng)（2013NZ02060295）；福建省科技星火項(xiàng)目（2016S01010055）

陳繼兵，男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槭卟诵缕贩N選育及推廣，電話：15859109091，E-mail：fzjb65@163.com

2016-12-08