張治平，戴海博，耿園

（揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇，225009）

葉面噴施不同濃度ALA對黃瓜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

張治平，戴海博，耿園

（揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇，225009）

為了探討葉面噴施5-氨基乙酰丙酸（ALA）在黃瓜苗期的施用濃度和效果，以黃瓜品種津春4號3葉1心期的幼苗為材料，研究了不同濃度ALA對黃瓜幼苗葉片光合色素含量和抗氧化酶系統(tǒng)的影響。試驗結果表明，葉面噴施10、30、50 mg/L的ALA可明顯提高黃瓜葉片葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）含量，降低Chl a/b比值；顯著增加超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化物酶（POD）活性，脯氨酸和可溶性蛋白含量；降低超氧陰離子（O2-·）生成速率、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量；當ALA濃度達100 mg/L時，黃瓜幼苗受到一定的氧化脅迫傷害。這些結果說明，噴施濃度不超過100 mg/L ALA可促進黃瓜幼苗葉片光合色素的合成、增加其抗氧化能力，降低膜脂過氧化的程度，綜合各項指標，以30 mg/L的ALA葉面噴施濃度在黃瓜幼苗上效果最佳。

黃瓜；5-氨基乙酰丙酸（ALA）；葉綠素；抗氧化酶；氧化脅迫

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物體內卟啉化合物（包括葉綠素、亞鐵血紅素、光敏素等）生成合成的第一個關鍵前體，與植物的光合作用、呼吸作用等有著密切關系，能夠調節(jié)植物的生長發(fā)育，促進作物的產量，提高植物的抗逆性[1～3]。然而ALA在黃瓜上的作用效果和施用濃度，目前存在著很大的差異。劉玉梅等[2]認為0.5 mg/L ALA噴灑幼苗可以提高黃瓜品種津優(yōu)1號葉片凈光合速率（Pn）和光化學效率，提高黃瓜幼苗亞適宜溫光環(huán)境的光合適應性。Zhen等[3]則認為50 mg/L ALA緩解鹽脅迫對津春2號黃瓜造成的傷害最明顯。Tripathy等[4]研究表明，噴施20 mmol/L ALA能夠造成黃瓜的光合電子傳遞鏈的光動力損傷。為了確定葉面噴施ALA在黃瓜幼苗期的最佳施用濃度和應用效果，本試驗以黃瓜（Cucumis sativusL.）品種津春4號為材料，研究葉面噴施不同濃度ALA對黃瓜幼苗葉片葉綠素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白的含量、以及O2-·生成速率和MDA含量的影響，皆在探討ALA在黃瓜應用上的濃度效應，以期為ALA在黃瓜生產上的推廣應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

本試驗以黃瓜品種津春4號為材料。挑選飽滿的種子用50℃溫水浸種滅菌10 min，30℃恒溫箱中催芽2 d，種子露白時，播種于裝有育苗專用基質（鎮(zhèn)江興農有機肥有限公司）的10 cm×10 cm（高度×口徑）黑色營養(yǎng)缽中，放入步入式植物生長箱（GBC-1600K型培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠）內，培養(yǎng)條件設定溫度為（25±1）℃/（18±1）℃（晝/夜），光周期為12 h/12 h（晝/夜），最大光照強度為10萬lx，育苗期間每天上午8：00澆透水。

1.2 材料處理

黃瓜幼苗培養(yǎng)至3葉1心期，選取生長一致的植株，用10、30、50、100 mg/L的ALA（粉劑，購于Sigma公司）溶液噴施，并設清水（0 mg/L ALA）對照。噴施時溶液中添加0.01%Triton，均勻的噴灑葉片的正反面，以葉片滴水為噴施標準。每個處理重復3次，每個重復20棵植株。ALA處理后第4天，取第2片真葉測定相關指標。

1.3 試驗方法

①葉片光合色素的含量測定采用參照Lichtenthaler[5]的方法，將黃瓜葉片剪碎放入小試管中，用95%乙醇提取液黑暗中靜置提取24 h，測定470、649、665 nm的OD值，并計算葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）、總葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）的含量以及Chl a/b的比值。

②抗氧化酶活性測定SOD活性測定按照Beauchamp等[6]的氮藍四唑（NBT）光還原法進行，以引起50%光化還原抑制率的酶量為一個酶活性單位（U）。CAT活性測定參照Change等[7]的方法，以每1 min OD240值減少0.01為1個酶活力單位（U）。APX活性測定參照Nakano等[8]方法。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，通過測定OD460的變化以測定POD的活力[7]。

③脯氨酸含量測定脯氨酸含量測定參照張殿忠等[9]的磺基水楊酸提取法。

④可溶性蛋白含量測定可溶性蛋白含量的測定按照Bradford[10]的考馬斯亮藍G-250染色法，并以標準的BSA作對照。

⑤O2-·生成速率、H2O2和MDA含量測定O2-·生成速率測定采用α-萘胺法[11]，H2O2含量的測定參照Brennan和Frenkel方法進行[12]，MDA含量的測定用硫代巴比妥酸（TBA）法，以μmol·g-1（鮮樣質量）表示[13]。

⑥統(tǒng)計分析上述各項指標的測定，均重復3次。采用Excel 2011和SAS軟件對數據進行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗，并作圖。

2 結果與分析

2.1 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片光合色素的影響

噴施ALA可以明顯改變黃瓜葉片光合色素的含量，不同濃度的ALA的噴施效果差異較大。噴施10、30、50 mg/L ALA可以明顯提高黃瓜葉片葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）的含量，顯著降低了Chl a/b的比值；與噴施清水對照（0 mg/L ALA）相比，黃瓜葉片的Chl a、Chl b、總Chl和Car的含量分別提高了3.92%～10.8%、13.1%～23.7%、6.81%～16.1%和1.26%～7.18%，同時Chl a/b的比值降低了7.92%～12.9%，ALA的作用效果30 mg/L ALA＞50 mg/L ALA＞10 mg/L ALA，30、50 mg/L ALA的作用效果與對照相比均達到了差異顯著水平。然而隨著ALA濃度繼續(xù)升高（至100 mg/L），與對照相比，黃瓜葉片的Chl a和Car的含量顯著降低；Chl b和總Chl的含量以及Chl a/b的比值無顯著變化（表1）。

表1 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片光合色素的影響

表2 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片脯氨酸、可溶性蛋白、H2O2、MDA含量及O2ˉ·生成速率的影響

2.2 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響

與對照相比，4種濃度ALA處理均增加了黃瓜葉片SOD、CAT、APX和POD的活性。但ALA對黃瓜幼苗葉片4種抗氧化酶活性的作用效果不一樣，即隨著ALA濃度的增加，SOD的活性逐漸增加，而CAT、APX和POD的活性則呈現先增加再減少的趨勢。黃瓜葉片SOD、CAT、APX和POD對ALA施用濃度反應也不一樣。噴施10、30、50、100 mg/L ALA處理的黃瓜葉片SOD的活性分別增17.4%。48.5%、56.2%、65.7%，且并到達了差異顯著水平（P＜0.05），但3種ALA濃度之間沒有明顯差異。ALA濃度為30、50 mg/L時，對APX、CAT和POD活性的增加效果顯著，為1.63～2.15倍；與對照相比，當ALA濃度為50 mg/L時，對APX和CAT活性增加的效果最為明顯，分別為93.3%和115.2%，POD活性增加的效果在ALA濃度為30 mg/L時表現的最明顯，其活性增加了105.3%。然而，當ALA濃度到達100 mg/L，CAT、APX和POD的活性有一定程度的降低，但仍顯著高于對照（P＜0.05）（圖1）。

圖1 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片抗氧化酶活性影響

2.3 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

噴施10、30、50、100 mg/L ALA的黃瓜葉片脯氨酸的含量顯著增加（P＜0.05），與對照相比分別提高了103%、192%、211%和115%。除100 mg/L的ALA處理對黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量影響不顯著外，其他處理的黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著地高于對照（P＜0.05），30 mg/L和50 mg/L ALA處理對黃瓜葉片的可溶性蛋白含量增加的效果較好，比對照提高了11.0%和14.3%（表2）。

2.4 噴施不同濃度ALA對黃瓜葉片O2-·生成速率、H2O2和MDA含量的影響

與對照相比，葉面噴施10、30、50 mg/L ALA顯著降低了黃瓜葉片O2-·生成速率，這3個ALA濃度處理的黃瓜葉片O2-·生成速率只有對照的61.4%～72.5%，以30 mg/L的ALA處理的O2-·生成速率降低的最為明顯；而100 mg/L的ALA處理的黃瓜葉片O2-·生成速率與對照相比差異不顯著。葉面噴施ALA對黃瓜葉片H2O2和MDA含量變化的影響效果一致，表現為10 mg/L ALA對黃瓜葉片H2O2和MDA含量沒有明顯影響；噴施30、50 mg/L ALA的黃瓜葉片H2O2和MDA含量與對照相比分別下降了74.8%～78.9%和69.5%～70.2%；當ALA濃度到達100 mg/L，黃瓜葉片H2O2和MDA含量比對照分別增加了123%、118%，增加效果顯著（P＜0.05）（表2）。

3 討論

在植物體內，ALA是葉綠素和血紅素的生物合成的第一個關鍵前體，CAT、POD和APX同屬于亞鐵血紅素蛋白酶類，因而外源施用ALA，葉綠素含量和抗氧化酶活性的變化最能直觀地反映出外源ALA的作用效果[1，14～16]。本研究發(fā)現低濃度ALA處理（10～50 mg/L）黃瓜幼苗，不僅能促進黃瓜葉片光合色素Chl a、Chl b、總Chl的增加，還對葉綠素的成分比例產生影響，ALA對Chl b的促進作用效果明顯大于Chl a，表現為與噴施清水對照相比Chl a/b的比值明顯降低。同時噴施10～50 mg/L ALA可以增加黃瓜葉片抗氧化酶SOD、CAT、APX和POD的活性，提高抗氧化物質Car和Pro的含量，降低了O2-·的生成速率，H2O2和MDA的含量。說明ALA在低濃度下可以促進黃瓜葉片光合色素的合成，增加黃瓜的抗氧化能力，這與前人研究ALA在油菜、番茄、辣椒等植物上施用效果的結果是一致的[14～16]。

ALA對植物生長發(fā)育調節(jié)作用的效果與ALA的施用濃度和作物種類密切相關，若ALA的濃度使用不當，則調節(jié)作用效果減弱，并能對作物生長造成過氧化的傷害[14，17，18]。Zhang等[14]研究表明1 mg/L ALA可以促進油菜的生長，而50 mg/L ALA誘導油菜體內過氧化物質積累，延緩植株的生長。100～400 mg/L ALA噴施紅掌幼苗葉片，可顯著增加葉綠素的含量，促進幼苗的生長，并以ALA 300 mg/L處理效果最佳[17]。即使在同一種作物上，ALA施用效果也存在著很大的差異[2～4]。本研究發(fā)現ALA對黃瓜品種津春4號幼苗的施用效果并不是和ALA的施用濃度成正比，而是存在一個最佳施用濃度，30 mg/L ALA施用效果最明顯。當ALA的濃度達到100 mg/L時，黃瓜葉片內的活性氧增加，脂膜過氧化程度增加，葉綠素含量降低，葉片顏色變淺，這可能是與ALA在高濃度下，一方面直接啟動細胞過氧化反應，生成如O2-·、H2O2和·OH等活性氧自由基，另一方面ALA代謝合成葉綠素和血紅素要經過一些的酶促反應，其中在黑暗條件，ALA可以轉化并積累光敏性很強的物質——原卟啉原IX或者原卟啉IX，這些物質如果黑暗中積累過量，再遇光，則誘發(fā)單線態(tài)氧，導致細胞的過氧化反應，傷害甚至殺死細胞[14，18]。因此在生產上推廣應用ALA，其施用方法和濃度必須按照植物的品種特性、施用時期和ALA的純度等進行嚴格的篩選，才能達到最佳的施用效果。

綜上所述，噴施ALA增強了黃瓜品種津春4號的光合色素的合成能力和抗氧化能力，降低O2-·生成速率，抑制膜脂過氧化的產生；黃瓜葉面噴施ALA的濃度不宜過高，30 mg/L ALA即可達到最佳的施用效果。

[1]Von Wettstein D,Gough S,Kannangara C G.Chlorophyll biosynthesis[J].Plant Cell,1995(7):1 039-1 057.

[2]劉玉梅，艾希珍，于賢昌.5-氨基乙酰丙酸對亞適宜溫光條件下黃瓜幼苗光合特性的影響[J].園藝學報，2010，37（1）：65-71.

[3]Zhen A, Bie Z L, Huang Y, et al. Effects of 5 -aminolevulinic acid on the H2O2-content and antioxidativeenzyme gene expression in NaCl -treated cucumberseedlings [J]. Biologia Plantarum, 2012, 56: 566-570.

[4]Tripathy B C, Chakraborty N. 5 -aminolevulinic acidinduced photodynamic damage of the photosyntheticelectron transport chain of cucumber (Cucumis sativus L.)cotyledons [J]. Plant Physiology, 1991, 96: 761.

[5]Lichtenthaler H, Wellburn A. Determination of totalcarotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts indifferent solvents [J]. Biochemical Society Transactions,1982, 11(5): 591-592.

[6]Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improvedassays and an assay applicable to acrylamide gels [J].Analytical Biochemistry, 1971, 44(1): 276-287.

[7]Chance B,Maehly A C.Assay of catalases and peroxidase[J].Methods in Enzymology,1955,2:764-775.

[8]Nakano Y,Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].Plantamp;Cell Physiology,1981,22(5):867-880.

[9]張殿忠，汪沛洪，趙會賢.測定小麥葉片游離脯氨酸含量的方法[J].植物生理學通訊，1990（4）：62-65.

[10]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[11]王愛國，羅廣華.植物的超氧物自由基與羥胺反應的定量關系[J].植物生理學通訊，1990（6）：55-57.

[12]Brennan T,Frenkel C.Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear[J].Plant Physiology，1977,59:411-416.

[13]趙生杰，許長成，鄒琦，等.植物組織中丙二醛測定方法的改進[J].植物生理學通訊，1994，30（3）：207-210.

[14]Zhang W F,Zhang F,Raziuddin R,et al.Effects of 5-aminolevulinic acid on oilseed rape seedling growth under herbicide toxicity stress[J].Journal of Plant Growth Regulation,2008,27(2):159-169.

[15]Zhang Z P,Miao M M,Wang C L.Effects of ALA on photosynthesis,antioxidant enzyme activity,and gene expression,and regulation of proline accumulation in tomato seedlings under NaCl stress[J].Journal of Plant Growth Regulation,2015,34(3):637-650.

[16]沈奇，劉濤，徐剛，等.ALA對辣椒低溫脅迫下傷害的緩解效應[J].江蘇農業(yè)學報，2012，28（2）：376-383.

[17]肖曉梅.噴施ALA對紅掌幼苗生長的影響[J].熱帶農業(yè)科學，2012，32（1）：8-11.

[18]Rebeiz C A,Montazer-Zouhool A,Hopen H J,et al.Photodynamic herbicides:1.concepts and phenomenology[J].Enzymeamp;Microbial Technology,1984,6（9):390-396.

Effects of Spraying Different Concentrations of ALA on Antioxidant Defense System of Cucumber

ZHANG Zhiping,DAI Haibo,GENG Yuan

(College of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Jiangsu 225009)

In order to explore the spraying concentrations and effects of exogenous 5-aminolevulinic acid(ALA)on cucumber seedling(Cucumis sativusL.),the experiment was conducted by spraying the Jinchun No.4 cucumber seedlings with different concentrations of ALA.Chlorophyll(Chl)content and the antioxidant enzymes(SOD,CAT,APX,POD)activity,proline and soluble protein content,and superoxide(O2-·)production rate,H2O2and malondialdehyde(MDA)content in leaves were investigated in this paper.The results showed that low concentration of ALA(10、30、50 mg·L-1)treatments could improve the contents of Chl a,Chl b,total Chl and Car,and significantly increase the activity of SOD,CAT,APX and POD and the contents of proline and soluble protein,but largely reduce superoxide(O2-·)production rate,H2O2and MDA content.While high concentration of ALA(100 mg·L-1)induced oxidative stress to cucumber seedlings.In conclusion,ALA application could promote the synthesis of photosynthetic pigments,enhance the capacity of the antioxidant defense system and protect the membrane from peroxidation.The optimum suitable concentration should not exceed 100 mg·L-1,and 30 mg·L-1ALA spraying treatment has the best effects on cucumber seedlings.

Cucumber;5-aminolevulinic acid(ALA);Chlorophyll;Antioxidant enzymes;Oxidative stress

S642.2

A

1001-3547（2017）20-0088-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.20.031

國家博士后基金項目（2015M580478）；江蘇省高校自然科學研究面上項目（15KJB210006）；揚州市自然科學基金——青年科技人才項目（YZ2014024）

張治平（1982-），女，博士，講師，主要從事蔬菜逆境生理和分子生物學研究，電話：18118251060，E-mail：zhangzp@yzu.edu.cn

2017-06-20