李東海，汪 雷，徐 濤

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)院，浙江 杭州 310077)

半夏快速繁殖及乙烯利對(duì)其增殖影響

李東海，汪 雷，徐 濤*

(浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)院，浙江 杭州 310077)

半夏快速繁殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.5 mg·L-1；生根培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1；在生根培養(yǎng)基中，低強(qiáng)度光照利于半夏組培苗萌發(fā)幼芽；高強(qiáng)度光照有利于半夏組培苗幼葉的展開和生長(zhǎng)；添加1 000倍商品用乙烯利有利于半夏塊莖的膨大和增殖。

半夏； 組織培養(yǎng)； 快速繁殖； 乙烯利

半夏Pinelliaternata又稱三葉半夏，為天南星科半夏屬多年生草本植物。中華人民共和國(guó)藥典記載[1]，藥用生半夏為半夏植株的干燥塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效，主要用于濕痰寒痰、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等，外治癰腫痰核。中國(guó)植物物種信息數(shù)據(jù)庫(kù)[2]記錄，除內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏尚未發(fā)現(xiàn)野生植株外，全國(guó)各地均有廣布，一般于海拔2 500 m以下草坡、荒地、玉米地、田邊、疏林下常見，朝鮮、日本等也有分布。

半夏組織培養(yǎng)一般使用6-BA、NAA、2,4-D等調(diào)節(jié)劑經(jīng)過(guò)數(shù)次繼代完成[3-5]，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，且成本較高[6]。本試驗(yàn)簡(jiǎn)化了半夏組織培養(yǎng)的繼代次數(shù)，并使用6-BA、乙烯利[7](化學(xué)式為乙烯磷，白色結(jié)晶，在常溫常壓下，能緩慢釋放出乙烯)，促進(jìn)了半夏塊莖的增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

半夏塊莖產(chǎn)地為浙江杭州天目山地區(qū)，流水沖洗1～2 h，除去表面土壤，挑選沉入水中且質(zhì)地堅(jiān)硬飽滿的半夏塊莖用于種植，然后清水浸泡，每6～8 h換1次水，共浸泡48～72 h，播種于播種盤中；商用乙烯利購(gòu)自浙江省花卉市場(chǎng)(浙江省農(nóng)科院旁)，純度30%。

1.2 外植體滅菌

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且未長(zhǎng)出珠芽的半夏葉柄，流水沖洗2 h，吸水紙瀝干后置于70%乙醇中，快速涮洗1～2次。然后放入含洗滌劑的0.1%HgCl2溶液中，搖勻8 min，用無(wú)菌水清洗3～5次，然后置于無(wú)菌濾紙片內(nèi)，去除兩端，接種于培養(yǎng)基內(nèi)。

1.3 無(wú)菌苗轉(zhuǎn)接

將接種超過(guò)1個(gè)月且已分化出葉片的無(wú)菌苗用小刀切開，接種于含6-BA 3.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基內(nèi)。每當(dāng)植株生長(zhǎng)過(guò)盛時(shí)，即可分離繼代。

1.4 培養(yǎng)條件與方法

半夏無(wú)菌培養(yǎng)配方：處理1，2,4-D 2.0 mg·L-1，暗培養(yǎng)；處理2，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培養(yǎng)；處理3，2,4-D 2.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1，暗培養(yǎng)；處理4，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 2.5 mg·L-1，光培養(yǎng)；處理5，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養(yǎng)；處理6，NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養(yǎng)；處理7，2,4-D 2.5 mg·L-1，暗培養(yǎng)→14 d后光培養(yǎng)；處理8，6-BA 3.5 mg·L-1，光培養(yǎng)→14 d后暗培養(yǎng)。

光培養(yǎng)的光照條件為1 000 lx，12 h·d-1；暗培養(yǎng)為避光培養(yǎng)。二者的培養(yǎng)溫度均為(25.5±1)℃。

1.5 乙烯利處理半夏無(wú)菌苗

乙烯利使用0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌，然后用純水分別稀釋10、100、1 000倍，待半夏接入不含激素的組培瓶?jī)?nèi)7 d后，每瓶添加1 mL稀釋后的乙烯利。

1.6 半夏組培苗的生根和移栽

將乙烯利處理過(guò)的半夏組培苗分離切割，接入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基內(nèi)(每瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基添加較少，半夏塊莖需埋入培養(yǎng)基內(nèi))。前期光照條件為500 lx，12 h·d-1，培養(yǎng)溫度為(25.5±1)℃；待有新芽抽出后轉(zhuǎn)入1 500 lx光照下將移栽的半夏組培苗提前2 d敞開組培瓶蓋，加入清水浸沒(méi)塊莖。然后植入滅菌過(guò)的土壤內(nèi)，覆上干苔蘚或干草。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)處理對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)

表1為8種培養(yǎng)條件下半夏的生長(zhǎng)情況。以接種30 d統(tǒng)計(jì)性狀，并記錄愈傷誘導(dǎo)率和嫩芽誘導(dǎo)率。其中，處理1、2、3形成半透明的泡狀細(xì)胞，無(wú)組織分化傾向(分化情況a)；處理4在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發(fā)于創(chuàng)口，20 d左右先萌發(fā)根，后長(zhǎng)出葉片(分化情況b1)；處理5在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發(fā)于創(chuàng)口，20 d左右長(zhǎng)出葉片，但不萌發(fā)根(分化情況b2)；處理6在7 d左右莖葉卷曲，有類似珠芽萌發(fā)于創(chuàng)口，20 d左右長(zhǎng)出葉片，萌發(fā)根(分化情況b3)。處理7的泡狀細(xì)胞偶有綠色星點(diǎn)位于細(xì)胞表面，后來(lái)無(wú)明顯變化(分化情況c)；處理8珠芽繼續(xù)萌發(fā)生長(zhǎng)，長(zhǎng)出白色莖葉，無(wú)根(分化情況d)。

表1 不同培養(yǎng)處理?xiàng)l件下半夏組織培養(yǎng)情況對(duì)比

2.2 半夏的芽增殖培養(yǎng)

如圖1所示，半夏在6-BA 3.5 mg·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 d時(shí)接種外植體切口處開始外翻；8 d時(shí)全部呈現(xiàn)泡狀，有白色嫩芽開始分化，出現(xiàn)于切口處；13 d時(shí)大量嫩芽出現(xiàn)，莖干中斷也有大量嫩芽；21 d時(shí)產(chǎn)生大量愈傷組織，原本嫩芽部分開始萌發(fā)出芽；28 d時(shí)大量芽分化萌發(fā)出來(lái)，開始出現(xiàn)葉片，整個(gè)植株團(tuán)簇狀；35 d時(shí)葉片形成，少數(shù)開始生長(zhǎng)出根部。

圖1 半夏增殖培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況

2.3 半夏組培苗的生根誘導(dǎo)和移栽

如圖2所示，半夏無(wú)菌苗接入并浸入6-BA 3.5 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基內(nèi)，大約15 d左右有根誘導(dǎo)分化(A)；將其放置于低強(qiáng)度光照條件下，會(huì)有大量芽分化出來(lái)(B)；然后將其轉(zhuǎn)移至稍強(qiáng)光照后，原本幼葉展開，并增大至正常形態(tài)(C)；將煉苗后的半夏組培苗種植于花盆內(nèi)，并附上干苔蘚(D)。

圖2 半夏組培苗的后期處理

2.4 乙烯利處理下半夏的塊莖變化

如圖3所示，正常組織培養(yǎng)狀態(tài)半夏塊莖簇集成大團(tuán)，青綠色，且一般塊莖上存在著半夏幼苗的萌芽，生長(zhǎng)活力好，質(zhì)地較為堅(jiān)硬，有光澤(A)；0.1%乙烯利時(shí)，半夏塊莖仍為青綠色，生長(zhǎng)活力較好，質(zhì)地稍微松軟(B)；1%乙烯利時(shí)，塊莖由青綠色轉(zhuǎn)為土黃色，活力逐漸喪失，質(zhì)地也更為松軟(C)；當(dāng)乙烯利濃度達(dá)到10%時(shí)，半夏塊莖全部變?yōu)橥咙S色，簇集成團(tuán)的塊莖松散開來(lái)，大部分塊莖呈現(xiàn)糜爛狀態(tài)，幾乎完全喪失了活性，即使后期更換正常培養(yǎng)后，無(wú)明顯改變(D)。

圖3 不同濃度乙烯利催化后半夏塊莖生長(zhǎng)狀況

3 小結(jié)與討論

光照對(duì)半夏嫩芽和芽的分化是必要條件，當(dāng)無(wú)光照培養(yǎng)時(shí)，半夏易于產(chǎn)生愈傷組織；當(dāng)光照強(qiáng)度在500 lx時(shí)，半夏生長(zhǎng)和芽的分化較多；光照強(qiáng)度在1 500 lx時(shí)，有利于葉片的伸展和增大。在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選取方面，6-BA和NAA均對(duì)半夏組織培養(yǎng)有促進(jìn)作用，但6-BA更能影響半夏的嫩芽生成和幼芽的萌發(fā)，NAA促進(jìn)半夏的根的誘導(dǎo)，2,4-D則有利于愈傷組織的分化。從試驗(yàn)中可以看出，0.1%乙烯利能促進(jìn)半夏生長(zhǎng)，增加組培瓶?jī)?nèi)半夏塊莖的增殖，但不影響塊莖的生成和其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累；而更高濃度的乙烯利則抑制半夏生長(zhǎng)，降低塊莖的活性，使其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累受阻，部分開始降解、自溶。

本試驗(yàn)使用配方簡(jiǎn)單，易于操作，且增殖系數(shù)大。通過(guò)調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，省略了傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的愈傷組織的脫分化和芽誘導(dǎo)步驟，直接從外植體分化出幼芽，并擴(kuò)增幼芽的基數(shù)，促進(jìn)葉片的展開和生長(zhǎng)。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，一定程度上減少了無(wú)菌苗的轉(zhuǎn)接次數(shù)，減少污染的可能；由于培養(yǎng)基更換量較少，降低了半夏組織培養(yǎng)的成本，節(jié)約了培養(yǎng)時(shí)間，適宜實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典1部[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 中國(guó)科學(xué)院. 中國(guó)植物物種信息數(shù)據(jù)庫(kù)[DB/OL]. http://db.kib.ac.cn/eflora/view/search/Chs_contents.aspx?CPNI=CPNI-128-15201.

[3] 劉鑫欣，崔曉星，劉金欣，等. 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011(5)：57-59.

[4] 宋艷梅，李峰，劉楊. 半夏組織培養(yǎng)快速繁殖研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010(4)：368-369.

[5] 賈明良，方荷芳，張本厚. 三葉半夏叢生塊莖途徑擴(kuò)繁及塊莖分離技術(shù)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2016(6)：181-186.

[6] 趙桂芳. 半夏組織培養(yǎng)成本分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015(10)：91-92.

[7] 祁利潘，孫明磊，李夢(mèng). 乙烯利對(duì)“冀張薯8號(hào)”產(chǎn)量和耐貯性的影響[C]//中國(guó)作物學(xué)會(huì)馬鈴薯專業(yè)委員會(huì)會(huì)議論文集，2016.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-09-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(30772712)

李東海(1988—)，男，湖北武漢人，碩士研究生，從事藥用植物代謝方面的研究工作，E-mail：493539063@qq.com。

徐 濤(1962—)，男，教授，從事藥用植物快速繁殖和代謝方面的研究工作，E-mail：pkuxt@aliyun.com。

文獻(xiàn)著錄格式：李東海，汪雷，徐濤. 半夏快速繁殖及乙烯利對(duì)其增殖影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(11)：1986-1988.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171136

Q813.2+2

A

0528-9017(2017)11-1986-03