種 焱,張兆平,馬樹寶,孫 博,許文燕,徐 晶

(1. 北京出入境檢驗檢疫局,北京 100026;2. 中關村聯(lián)合創(chuàng)新(北京)生物科技有限公司,北京 102206)

進口基因檢測用動植物DNA/RNA風險分析

種 焱1,張兆平1,馬樹寶1,孫 博1,許文燕1,徐 晶2

(1. 北京出入境檢驗檢疫局,北京 100026;2. 中關村聯(lián)合創(chuàng)新(北京)生物科技有限公司,北京 102206)

近年來,我國在基因檢測方面正在積極搶占國際市場份額.然而該產業(yè)的時效性要求很高,因此進出口通關效率至關重要.北京出入境檢驗檢疫局在對進口基因檢測用動植物DNA/RNA進行系統(tǒng)地風險分析后認為,經純化的動植物DNA/RNA不具備感染其它生物體的條件,無傳染性,檢疫風險極低,并據(jù)此提出了檢疫監(jiān)管建議.

檢疫監(jiān)管;風險評估;基因檢測;DNA;RNA

近年來基因檢測行業(yè)發(fā)展迅速.2015年全球基因測序市場規(guī)模接近60億美元,2016年超過了60億美元,直逼70億美元,預計2018年全球市場規(guī)模將達到117億美元,未來4年年復合增長率將達到21%[1].我國在基因檢測方面正在積極搶占國際市場份額.然而該產業(yè)的時效性要求很高,因此進出口通關效率對產業(yè)發(fā)展至關重要.

1 基本情況

1.1 DNA/RNA定義

核酸是遺傳信息攜帶者,是生命的最基本物質.它和蛋白質是構成生物體的主要成分.按化學組成,可以將核酸分成兩大類:脫氧核糖核酸(DNA),主要存在于細胞核中;核糖核酸(RNA),主要存在于細胞質中.在生物體中,核酸以結合成核蛋白的形式存在,但其極不穩(wěn)定,在較劇烈的物理、化學因素和酶的作用下都很易降解.

本文所指動植物DNA/RNA為商業(yè)化基因測序用途的動植物DNA/RNA,不包括微生物DNA/RNA.

1.2 產業(yè)發(fā)展歷程

基因檢測的發(fā)展已經歷了3個階段:

第1階段,1987年第1臺自動化測序儀ABI370問世(Sanger測序法),并被廣泛運用于科研和臨床.但Sanger測序法因有對電泳分離技術依賴的局限性,以及無法再進一步擴大和微量化,造成出現(xiàn)序列測定的規(guī)模限制和高昂代價.如,繪制第l張人類基因組圖譜,前后就耗費了13年時間.

第2階段,以Roche公司的454技術,Illumina公司的Solexa、Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為標記的第2代測序技術誕生.第2代測序技術的出現(xiàn),使基因研究快速發(fā)展,測序成本大大降低.據(jù)資料顯示,全基因組測序在2001年需耗費100萬美元,而在第2代測序技術的幫助下,2011年已經下降到1萬美元;人的全基因組測序只需一周左右時間即可完成.近年來,隨著2代測序技術的蓬勃發(fā)展,高通量的基因測序技術日臻成熟,逐漸從常規(guī)基礎科研實驗室應用轉入臨床醫(yī)學應用.

第3階段,以PacBio公司的SMRT和Oxford nanopore technologies納米孔單分子測序技術為代表,被稱之為第3代測序技術.與前兩代相比,其最大的特點就是單分子測序,測序過程中無需進行PCR擴增.2011年發(fā)布的 PacBio RS系統(tǒng)已成為首個成熟商業(yè)化應用的第3代測序平臺.2015年推出的全新PacBio sequel 測序平臺,通量更高、體積更小,測序成本更低,可大大縮短項目周期.第3代測序平臺已被用于臨床尋找基因致病突變.

1.3 產業(yè)發(fā)展需求

隨著經濟的不斷發(fā)展和測序市場的規(guī)范化,我國測序市場發(fā)展增速明顯,已進入快速發(fā)展期.2016年測序市場規(guī)模約為54億元人民幣,預計2020年將突破百億元人民幣,年復合增長率預計為20%～25%.基因檢測時效性要求極高,國外一般要求在10～15個工作日內出具檢測報告(含國際運輸、清報關和上機檢測).因此,樣品進口速度直接影響到我國基因檢測產業(yè)的發(fā)展.

2 風險評估

本文通過定性分析進口基因檢測用DNA/RNA的分離純化、包裝運輸和檢疫瞞報風險,評估檢疫風險,進而提出檢疫監(jiān)管建議.

2.1 傳入評估

2.1.1 DNA/RNA的分離與純化工藝.采用quot;物理+化學quot;方法,去除蛋白質、脂類、糖類等其他分子的污染,分離純化DNA/RNA.

2.1.1.1 動物組織DNA的提取方法.SDS法:將分散好的組織細胞放入含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中進行蛋白質消化分解,再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質,將得到的DNA溶液,用乙醇沉淀,使DNA從溶液中析出.

2.1.1.2 植物組織DNA的提取方法.CTAB法:CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)在高離子強度的溶液中(gt;0.7 mol/L NaCl),可與蛋白質和多聚糖形成復合物,僅不能沉淀核酸.利用有機溶劑抽提去除蛋白多糖酚類等雜質后,加入乙醇沉淀,即可將核酸分離出來.

2.1.1.3 血液DNA的提取方法.主要采用quot;紅細胞裂解+SDSquot;法.

2.1.1.4 RNA提取方法.目前的RNA提取均采用成品試劑盒.比如,對動物組織/細胞,采用動物組織/細胞RNA提取試劑盒(RNApureTissueamp;Cell Kit);對植物RNA,采用植物RNA提取試劑盒(RNApure Plant Kit);對血液RNA,采用天根血液RNA提取試劑盒(RNApure Blood Kit).

2.1.2 純化不徹底的檢疫風險.制備動植物組織、微生物、血液樣品DNA及RNA的工藝和方法,均使樣品中的蛋白質得到化學變性(SDS、CTAB等)處理,從而使其不再具備生物活性,因而提純后的DNA和RNA樣品不再有傳染性和造成疫病傳播的可能性.

2.1.3 實驗環(huán)境污染的檢疫風險.DNA制備所需的所有試劑(SDS、CTAB、EDTA、酚氯仿、乙醇等)均為常規(guī)的化學試劑,無傳染性,不會造成疫病傳播風險.

2.1.4 制備后感染病原微生物的可能性評估.通過DNA和RNA制備工藝處理后,保存液中(純水)僅有純化的DNA和RNA,不存在任何具有傳染性和可能造成疫病傳播風險的化學試劑.且在純水的環(huán)境下,DNA和RNA亦不具備合成蛋白質或者侵染組織細胞的能力,因而無傳染性,不會造成疫病傳播風險.同時,出于商業(yè)要求,基因檢測用DNA/RNA在出口前均經過了嚴格的完整性和純度驗證,可確保其檢測結果的可靠性.因此,進境基因檢測用動植物DNA/RNA樣本自身檢疫風險極低.

2.2 暴露發(fā)生評估

2.2.1 樣本運輸?shù)馁|量控制.通常DNA溶液需要-20 ℃冷凍保存.如果長期保存(≥2年)最好是-40 ℃或者-80 ℃保存.使用TE緩沖液溶解DNA,有助于保持DNA的穩(wěn)定性.對RNA,建議保存在-80 ℃冰箱中.另外,由于環(huán)境中的RNase無處不在,提純的RNA容易被降解,所以RNA的保存需要使用DEPC水等去除RNase活性的滅菌去離子水.

2.2.1.1 干冰運輸 .根據(jù)干冰量,準備大小適當?shù)呐菽?在其中放入干冰(需要10 kg,至少為8 kg)和標本(用塑料袋或者塑膠手套裝好),將盒子內的空隙用舊報紙塞滿,以防干冰揮發(fā)后有液體流出.干冰運輸時需選擇較厚的泡沫盒;在運輸過程中為避免因保存管破裂而導致的DNA/RNA溶液污染,需使用封箱帶密封泡沫盒;最后將其放入紙箱內,再次用封箱帶密封.

2.2.1.2 冰袋運輸.將需要提取RNA的細胞或組織樣品溶解在Trizol溶液中.短期運輸過程(≤5 d)中可以使用冰袋.

2.2.1.3 液氮運輸.運輸時間超過5 d時,可以適當采用液氮運輸.將裝有DNA/RNA樣品的保存管包裝、密封,投入干式液氮罐中密封運輸.注意事項:將收集的各類樣品用凍存管或離心管裝好,保存在低溫冰箱或者液氮中;對所使用的1.5 mL凍存管或離心管、槍頭等,必須進行高溫滅菌處理;裝好樣品后,將管口以封口膜封好;對冷凍的DNA/RNA樣品,應避免反復凍融.

2.2.1.4 樣本運輸過程中的查驗.對樣本查驗等較暴露處理過程,均采取2人合作的方式.這樣既縮短了樣本在非超低溫環(huán)境中停留的時間,又形成了對樣本的雙重檢查,保證了樣本信息的準確性.為保證樣本質量,樣本的查驗、使用者信息反饋及樣本質量檢測均按照樣本運輸?shù)臉藴驶鞒虈栏癫僮?在信息化管理方面,采用二維碼標簽,嚴格管理樣本運輸節(jié)點,對每份樣本均可通過二維碼追溯到樣本供應者的基本信息資料,健康狀況及樣本采集、運送、接收、存放情況,目前使用情況和使用中產生的其他信息資料,銷毀的記錄以及后續(xù)監(jiān)管所需信息.

2.2.2 樣本瞞報的檢疫把關.目前對DNA/RNA樣本完整性和純度控制常用的方法有電泳法、分光光度法.電泳法主要用于測定樣本的完整性,分光光度法主要用于鑒定其純度(表1).檢疫執(zhí)法把關中,在無法確定樣本純度的情況下,必要時通過分光光度法,快速鑒定進口樣本是否為DNA/RNA,從而堵住檢疫瞞報漏洞.因此,DNA/RNA包裝運輸安全可靠,純度鑒定簡單易行.

表1 基因檢測用DNA/RNA質量控制

2.3 相關國家檢疫要求參考

經調研歐洲區(qū)亞太區(qū)相關人員,科研用的NDA/RNA進口一般不需要任何證明或審批.有些城市可能會要求出具保證函、非危保函,此時可個人簽名出具即可.

美國農業(yè)部(USDA)在其網站上明確列明了以下材料進口不需要農業(yè)部進口許可證,但將在入境口岸審查(圖1).

圖1 美國農業(yè)部(USDA)無需進口許可部分產品名單

3 評估結論

由上述分析可判定:

(1)采用quot;物理+化學quot;方法所提純的檢測用動植物DNA/RNA均具有傳染性.

(2)檢測用動植物DNA/RNA在制備過程中全部使用化學試劑,且制備環(huán)境要求嚴格,因此在中間環(huán)節(jié)污染的可能性極低.

(3)制備后的成品經洗凈處理后,保存于純水環(huán)境中,因此在保存、運輸環(huán)節(jié)被污染的可能性極低.

(4)所有檢測用DNA/RNA經提純后均要經過純度和完整性驗證,可確保其可靠性.

(5)經過純化的DNA/RNA均已被解鏈、暴露,在沒有相關酶、引物和寡核糖核苷酸的情況下,其復制、轉錄/反轉錄等生理機制不可能發(fā)生,即使是微生物遺傳物質,也不存在傳染的可能.

因此,經純化的動植物DNA/RNA不具備感染其它生物體的條件,無傳染性.

4 檢疫監(jiān)管建議

鑒于基因檢測用動植物DNA/RNA均經過提純、滅活、固定等處理,不具有攜帶、傳播動植物疫病的可能.為滿足產業(yè)發(fā)展需求,提升進出口效率,建議如下:

對基因檢測用進境動植物DNA/RNA,進口時只需隨附國外提供者出具的成分說明和安全聲明,口岸查驗合格后,即可直接放行,必要時只需通過分光光度法進行純度鑒定.

對于進境的致病性微生物DNA/RNA,由于后期改造后仍具有傳染性,出于生物安全考慮,進口檢疫時需從嚴要求.

[1] 鄧和平,廖曉磊. 全球基因測序領域專利分析[J]. 中國發(fā)明與專利,2017,14(3):39-44.

[2] 基因測序行業(yè)報告[EB/OL].(2015-10-27)[2017-08-16]. http://www.360doc.com/conte nt/15/1027/22/4102591_508834732.shtml.

[3] 基因測序市場行業(yè)分析:誰主沉浮?[EB/OL]. (2017-02-12)[2017-08-16]. http://www.instrument.com.cn/news/20170212/212726.shtml.

(責任編輯:朱迪國)

Risk Assessment for Animal and Plant DNA/RNA Used in Gene Detection during Importation

Chong Yan1,Zhang Zhaoping1,Ma Shubao1,Sun Bo1,Xu Wenyan1,Xu Jing2
(1. Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026;2. Beijing Zhongguancun Biocenter Co.,Ltd,Beijing 102206)

In recent years,China is actively seizing the international market share in the field of gene detection.However,the timeliness of the industry is very high,so the efficiency of import and export customs clearance is crucial. Based on the systematic risk assessment for animal and plant DNA/RNA used in gene detection during importation by Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,it was considered that the purified animal and plant derived DNA/RNA didn't have the ability to infect other organisms,with no infectivity and extra-low quarantine risk. And suggestions for quarantine supervision were put forward accordingly.

quarantine and inspection;risk assessment;genetic test;DNA;RNA

S851.33

A

1005-944X(2017)12-0039-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.010

馬樹寶