肖 妍,趙祥平,董志珍,張永年,王 勤,張俊哲,趙 丹,王建華

(1. 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心,天津 300461;2. 中國檢驗檢疫生命科學(xué)研究院,北京 100123)

兩種ELISA試劑盒與血清中和試驗檢測牛赤羽病的比較

肖 妍1,趙祥平1,董志珍1,張永年1,王 勤2,張俊哲1,趙 丹1,王建華1

(1. 天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心,天津 300461;2. 中國檢驗檢疫生命科學(xué)研究院,北京 100123)

為比較兩種商品化赤羽病抗體ELISA試劑盒的敏感性和特異性,以及ELISA和微量血清中和試驗(SNT)的符合率,采用兩種ELISA試劑盒和血清中和試驗,對690份澳大利亞純種荷斯坦奶牛血清進(jìn)行牛赤羽病檢測.試驗結(jié)果顯示:法國某公司生產(chǎn)的赤羽病ELISA試劑盒敏感性為93.42%,特異性為81.23%,與SNT 間的Kappa值為0.615,為高度符合;日本某公司生產(chǎn)的赤羽病ELISA試劑盒敏感性為39.47%,特異性為96.1%,與SNT 間的Kappa值為0.427,為中度符合.比較結(jié)果表明:日本某公司生產(chǎn)的試劑盒敏感性較低,容易漏檢,不適合用于牛赤羽病初篩;在出入境檢疫中,可以采用高通量、半自動化、敏感性高的ELISA方法,對血清樣本進(jìn)行篩選,再采用特異性強的SNT試驗進(jìn)行輔助驗證.

赤羽病;ELISA;微量血清中和試驗;比較試驗

赤羽病(Akabane disease,AKAD)又稱阿卡斑病,是由布尼病毒屬辛波(Simbu)病毒群的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)引起牛、綿羊和山羊等動物發(fā)生的一種以流產(chǎn)、早產(chǎn),產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎,以及新生胎兒發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦綜合征為臨床特征的病毒性傳染病.本病首次于1949年在日本群馬縣赤羽村發(fā)生;1961年在日本群馬縣赤羽村的畜舍內(nèi)采集的兩種蚊蟲體內(nèi)分離出病毒,并命名為赤羽病病毒[1].該病多發(fā)生于熱帶和溫帶,為蟲媒性傳染病,主要傳播媒介是蚊和庫蠓[2-3].澳大利亞、以色列、日本、肯尼亞、南非、印度尼西亞、馬來西亞、非律賓都曾有本病的報道.我國也有在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)血清抗體陽性動物的報道,并于1998年首次報道分離鑒定出病毒[4-6].赤羽病是目前對養(yǎng)牛業(yè)和養(yǎng)羊業(yè)危害較為嚴(yán)重的疾病,是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定通報疾病,也是我國從國外進(jìn)口牛、羊必須檢測的疫病之一,是我國《進(jìn)境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的二類傳染病.對赤羽病的診斷,很少采用病毒分離鑒定的方法,而是采用組織病理學(xué)和血清學(xué)方法,在進(jìn)出口檢疫中普遍采用血清學(xué)方法.ELISA和微量血清中和試驗(SNT)為OIE 規(guī)定的國際貿(mào)易中牛羊赤羽病檢疫指定試驗.

1 材料

1.1 試驗樣本

為比較商品化赤羽病抗體ELISA試劑盒的敏感性和特異性,以及ELISA和SNT的符合率,本試驗對690頭澳大利亞純種荷斯坦奶牛,于進(jìn)入隔離場7 d后,分別逐頭采集血樣,分離血清,用于ELISA檢測和微量血清中和試驗檢測.SNT用血清經(jīng)56 ℃、30 min 滅活.

1.2 主要試劑與儀器

赤羽病ELISA試劑盒分別為日本某公司生產(chǎn)和法國某公司生產(chǎn);微量血清中和試驗所用細(xì)胞為Vero細(xì)胞;所用種毒為AKAV;AKAV陽性血清和陰性血清為澳大利亞EMAI 實驗室惠贈;主要儀器有全自動酶標(biāo)儀、自動洗板機.

2 方法

2.1 ELISA試驗

分別用法國某公司生產(chǎn)的試劑盒(ELISA-1)和日本某公司生產(chǎn)的試劑盒(ELISA-2),對690份奶牛血清樣品進(jìn)行ELISA檢測.方法按照試劑盒說明書操作.

2.2 微量血清中和試驗

對690份奶牛血清樣品進(jìn)行微量血清中和試驗檢測.方法按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1128-2007)進(jìn)行操作.

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3.1 敏感性(DSe)和特異性(DSp)計算

以SNT試驗結(jié)果為基準(zhǔn),按照下列計算公式計算每種試劑盒的DSe和DSp,并對兩種ELISA試劑盒進(jìn)行評價.

計算公式:DSe = A/(A+C);DSp = D/(B+D)

表1 DSe和DSp數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3.2 試劑盒與SNT間的Kappa值計算

按照下列公式計算試劑盒與SNT間的Kappa值,比較試劑盒與SNT的符合程度.

如果Kappa值在0.81～1,說明兩個方法間完全符合;在0.61～0.8,為高度符合;在0.41～0.6,為中度符合;0.21～0.4,為比較符合;0.2以下為輕度符合;0以下為不符合.

表2 Kappa值計算數(shù)據(jù)統(tǒng)計

4 結(jié)果

本次測定結(jié)果顯示,ELISA-1試劑盒(法國)的敏感性為93.42%,特異性為81.23%;ELISA-2試劑盒(日本)的敏感性為39.47%,特異性為96.1%(表3).結(jié)果表明,ELISA-2試劑盒的敏感性較低,容易漏檢,不適合用于赤羽病的初篩檢測.不同ELISA試劑盒與SNT 間的Kappa值計算結(jié)果見表4、表5.

表3 DSe、DSp測定結(jié)果

表4 ELISA-1(法國) 與SNT 單位:份

表5 ELISA-2(日本)與SNT 單位:份

5 討論與結(jié)論

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及病理變化特征,可對赤羽病作出初步判斷,但確診需要進(jìn)行實驗室檢驗.赤羽病的實驗室診斷方法分為病原學(xué)鑒定和血清學(xué)試驗.目前在赤羽病出入境檢疫或臨床檢疫時,通常采用ELISA和SNT進(jìn)行檢測.

由表3、表4、表5可知,法國某公司的ELISA試劑盒與SN試驗相比敏感性為93.42%,特異性為81.23%,Kappa值為0.615,與SNT高度符合;日本某公司的ELISA試劑盒與SNT相比敏感性為39.47%,特異性為96.1%,Kappa值為0.427,與SN試驗中度符合.

ELISA方法的敏感性高,SNT方法的特異性強.ELISA 方法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;SNT操作復(fù)雜,細(xì)胞易受污染,檢測周期長,不適用于大批量動物血清樣品的檢測.因為日本某公司的ELISA試劑盒的敏感性較低,所以會出現(xiàn)漏檢情況,不適合用于赤羽病的初篩檢測.而法國某公司的ELISA 試劑盒與SNT高度符合,因此在出入境檢疫中,可選用該試劑盒對血清樣本進(jìn)行ELISA篩選試驗,再采用特異性強的SNT進(jìn)行輔助驗證.

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(責(zé)任編輯:朱迪國)

Comparative Study of Two ELISA Kits and Serum Neutralization Test in Detecting Akabane Disease of Cattle

Xiao Yan1,Zhao Xiangping1,Dong Zhizhen1,Zhang Yongnian1,Wang Qin2,Zhang Junzhe1,Zhao Dan1,Wang Jianhua1
(1. Animal and Plant and Food Stuffs Inspection Center,Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300461;2. China Inspection and Quarantine Life Sciences Research Institute,Beijing 100123)

To compare the 2 commercial ELISA kits from the aspects of the diagnostic sensitivity(DSe),the diagnostic specificity(DSp),and the coincidence rate of ELISA and serum neutralization test(SNT),the Akabane disease detection was carried out towards 690 serum samples of cattle imported from Australia,by two ELISA kits and serum neutralization test. The results showed that the DSe of the ELISA kit from a French company was 93.42%,the DSp was 81.23% and the Kappa with SNT was 0.615,which was consistent highly. The DSe of the ELISA kit from a Japan company was 39.47%,the DSp was 96.1% and the Kappa with SNT was 0.427,which was consistent moderately. The comparative results showed that the DSe of kit produced by Japanese company was low,and it was easy to miss detection,which was unsuited for Akabane disease detection. In the entry and exit quarantine,a high throughput,semi-automated and highly sensitive ELISA method could be used to screen the serum samples,and the SNT test with high DSp was carried out to assist the verification.

Akabane disease;ELISA;micro-serum neutralization test;comparative test

S945.4

A

1005-944X(2017)12-0081-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.023

天津出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(TK102-2013)