雷宇平,王仲兵,楊治平,張仲萍,王治維,胡明明

(山西省動物疫病預(yù)防控制中心,山西太原 030027)

豬鏈球菌熒光定量PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用

雷宇平,王仲兵,楊治平,張仲萍,王治維,胡明明

(山西省動物疫病預(yù)防控制中心,山西太原 030027)

為快速診斷和檢測豬鏈球菌病,根據(jù)GenBank中已登錄的豬鏈球菌抗原基因保守區(qū)域序列,設(shè)計并合成特異性引物及Taqman探針,通過優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件,構(gòu)建了快速、準(zhǔn)確檢測豬鏈球菌的Taqman熒光定量PCR檢測方法(Taqman FQ-PCR),測定了該方法的靈敏性、重復(fù)性和特異性,并對疑似豬鏈球菌臨床感染樣本進(jìn)行了檢測.結(jié)果顯示:所建立的Taqman FQ-PCR方法檢測靈敏度為1X102拷貝/μL;對3種不同濃度的豬鏈球菌重組質(zhì)粒進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增,變異系數(shù)均小于3%,說明重復(fù)性好;特異性檢測顯示,只有豬鏈球菌樣本的擴(kuò)增曲線呈陽性反應(yīng),其他致病菌均無熒光信號;采用此方法,對30份臨床疑似豬鏈球菌感染樣本進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)有27份樣本為陽性,比采用國標(biāo)法檢測得到的結(jié)果更加靈敏.結(jié)果表明,建立的FQPCR方法具有靈敏性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點,可用于豬鏈球菌的快速診斷和檢測.

熒光定量PCR;豬鏈球菌;檢測;探針

豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)是一種人獸共患病原菌,臨床上主要引起豬腦膜炎、腦炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、流產(chǎn)及支氣管肺炎等[1],不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全.1999年夏季,此病在江蘇省暴發(fā),造成25人感染,14人死亡[2],2005年在四川省暴發(fā),導(dǎo)致43人死亡[3].因此,SS的快速檢測對預(yù)防和及時控制該病的傳播十分重要.

目前,SS的檢測方法主要為常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定.這幾種方法不僅耗時耗力,而且靈敏度不高,結(jié)果不準(zhǔn)確.而熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)具有速度快、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點,可以彌補(bǔ)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)檢測方法的不足并且可以準(zhǔn)確測定樣品中病原微生物數(shù)量,因而被廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測[4].本研究以SS抗原基因為靶基因,設(shè)計引物和探針,建立了SS的FQ-PCR檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株.SS以及豬生活環(huán)境中常見的菌群,如豬副溶血嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬布魯氏菌、丹毒桿菌等,均由本實驗室保存.

1.1.2 儀器與試劑.7500 Fast Real-Time PCR儀、Beckman coulter DU640型核酸蛋白檢測儀(美國ABI公司);Premix Ex TaqTM試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000(Takara公司);細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(Generay biotech公司).

1.2 引物與Taqman探針

根據(jù)GenBank中已登錄的SS抗原基因序列,分析基因保守區(qū);應(yīng)用Primer Express 3.0軟件,設(shè)計特異性引物及探針,并通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST功能,對其特異性進(jìn)行初步鑒定,再由上海生工合成探針的5′端(用FAM標(biāo)記)和3′端(用BHQ1標(biāo)記).具體引物和探針序列見表1.

表1 引物與探針序列

1.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

將含有SS抗原基因的部分片段構(gòu)建于PUC57質(zhì)粒上,制成重組克隆菌,用于后續(xù)擴(kuò)增實驗.提取重組質(zhì)粒,用紫外分光光度計測OD260、OD280及OD260/OD280值,重復(fù)3次,確定質(zhì)粒DNA濃度和純度,計算拷貝數(shù)并稀釋至1X105拷貝/μL,–20℃保存?zhèn)溆?拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度X6.02X1023/(660X質(zhì)?？傞L度).

1.4 檢測樣品及DNA提取

對疑似SS感染的30只病豬扁桃體組織進(jìn)行采樣檢測.無菌環(huán)境下稱取扁桃體組織1 g放入研缽中,加入2.5 mL生理鹽水,充分研磨混勻后,取150 μL 研磨液,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,提取基因組DNA,采用紫外分光光度計,測定模板DNA的濃度與純度,將獲得的DNA樣品于–20 ℃保存?zhèn)溆?

1.5 熒光定量PCR體系的建立

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABI7500 Fast Real-Time PCR儀上進(jìn)行.熒光定量PCR初始反應(yīng)體系(25 μL):5XPCR buffer 5 μL、50 μmol/L 引 物 各 0.1 μL、50 μmol/L 探 針 0.05 μL、10XdNTP 0.9 μL、DNA polymerase(1 U/μL)1 μL、ddH2O 13.85 μL、DNA模板4 μL.反應(yīng)程序為:42 ℃ 20 min,95 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,40個循環(huán).根據(jù)以上反應(yīng)及擴(kuò)增條件,以陽性質(zhì)粒為模板,分別對引物濃度范圍(5～10 μmol/L)、探針濃度范圍(2.5 mmol/L～7.5 μmol/L)和退火溫度(52～60 ℃)進(jìn)行優(yōu)化.引物探針濃度以2 μmol/L遞增,退火溫度以2 ℃遞增,確定PCR反應(yīng)條件.

1.6 靈敏度檢測

將已定值的SS重組質(zhì)粒稀釋至1X105拷貝/μL,再10倍系列稀釋5個梯度,以1X101～1X104拷貝/μL的稀釋液為模板,每個梯度重復(fù)3次,確定其靈敏度.

1.7 精密性和重復(fù)性試驗

取1X102、1X103和1X105拷貝/μL 3個濃度的重組質(zhì)粒,進(jìn)行3次批內(nèi)和批間平行試驗,每個梯度重復(fù)10次,計算變異系數(shù)(CV),判定該方法的精密性和可重復(fù)性.

1.8 特異性試驗

采用優(yōu)化后的方法,對SS、豬副溶血嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬布魯氏菌、丹毒桿菌的核酸進(jìn)行檢測,并設(shè)空白對照,以驗證該方法的特異性.

1.9 臨床應(yīng)用試驗

提取疑似SS感染的30只病豬扁桃體組織的總DNA;以SS重組質(zhì)粒為陽性對照,以ddH2O為空白對照,以健康豬的扁桃體組織總DNA為陰性對照,按照最終優(yōu)化的條件進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增;同時對以上樣品進(jìn)行國標(biāo)法復(fù)檢,以驗證兩者之間的符合率.

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR的建立

優(yōu)化后的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(25 μL)為:5XPCR buffer 5 μL、50 μmol/L 引物各 0.15 μL、50 μmol/L 探 針 0.1 μL、10XdNTP 0.9 μL、DNA polymerase(1 U/μL)1 μL、ddH2O 13.7 μL、DNA模板 4 μL.反應(yīng)程序為:42 ℃ 20 min,95 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,40個循環(huán).陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)以Ct值lt;35且擴(kuò)增曲線呈S型為陽性;Ct值在35～37之間時,需重復(fù)2次試驗,若均為良好的S型擴(kuò)增曲線方,可判定為陽性.

2.2 靈敏度試驗

將已定值的SS重組質(zhì)粒倍比稀釋至最小為1X101拷貝/μL,并以此作為實時熒光定量PCR的反應(yīng)模板(圖1).可得出,此方法的檢測下限為 1.0X102拷貝 /μL.

圖1 實時熒光定量PCR靈敏度試驗

2.3 重復(fù)性試驗

1X105、1X103、1X102拷貝 /μL 的標(biāo)準(zhǔn)樣品的變異系數(shù)在批內(nèi)和批間分別為2.00%、1.20%、1.23%和1.89%、1.32%、1.44%(表1),均低于3%,說明該方法具有較好的精密性和重復(fù)性.

表1 實時熒光定量PCR重復(fù)性試驗

2.4 特異性試驗

以SS、豬副溶血嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬布魯氏菌、丹毒桿菌作為特異性試驗的對照組,進(jìn)行實時熒光定量PCR.檢測結(jié)果中只有SS樣本有擴(kuò)增曲線,其他對照組無擴(kuò)增曲線,表明該試驗方法具有較高的特異性(圖2).

圖2 實時熒光定量PCR靈敏度試驗

2.5 臨床樣本檢測

對30份疑似SS感染臨床樣品,采用實時熒光定量PCR直接檢測,共檢測出SS陽性樣品24份(表2).同樣采用國標(biāo)法(GB 19915.7-2005)復(fù)檢結(jié)果,發(fā)現(xiàn)FQ-PCR檢測結(jié)果與國標(biāo)法檢測結(jié)果相符,并且比傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法具有更高的靈敏性.

表2 30例臨床樣品檢測

3 討論與結(jié)論

SS是豬飼養(yǎng)過程中常見的一種條件致病菌,通常感染豬的上呼吸道,特別是扁桃體以及鼻腔、生殖道和消化道,可引起關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等,嚴(yán)重時可引起敗血癥、腦膜炎;人感染后則常發(fā)生化膿性腦炎、腹膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎以及眼內(nèi)炎等疾病,甚至導(dǎo)致死亡[5-9].該病原菌嚴(yán)重威脅了食品安全和畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn).因此加強(qiáng)對SS的檢測力度,對預(yù)防和控制豬鏈球菌病意義重大[10].

目前,傳統(tǒng)的SS分離鑒定及常規(guī)的PCR檢測耗時長、易污染、步驟繁瑣、敏感性低,還可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11].本試驗建立的FQ-PCR不僅具有常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增高效率優(yōu)勢,而且具有高度特異性、敏感性和可重復(fù)性等特點,已被廣泛運(yùn)用于臨床醫(yī)療、病原菌檢測等體外擴(kuò)增技術(shù)[12].本研究中采用的探針結(jié)合引物辦法,具有更高的特異性,并且使用該方法對其他細(xì)菌進(jìn)行檢測顯示,只有SS有擴(kuò)增曲線,再次證明該方法具有良好的特異性.對同一個濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行多次重復(fù)試驗,得出的變異系數(shù)均低于3%,表明該方法具有很好的重復(fù)性和敏感性.采用此方法進(jìn)一步對30份疑似SS感染的臨床樣品進(jìn)行檢測,得到的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定結(jié)果一致,并且可以檢測出國標(biāo)法未檢測出來的陽性樣品,再次表明所建立的方法具有較高的靈敏度.

該研究成功建立了SS的FQ-PCR方法,實現(xiàn)了SS的快速、高效、準(zhǔn)確檢測,對控制該病原菌的傳播和流行提供了一項新的技術(shù)支持.

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(責(zé)任編輯:杜憲)

Establishment of Fluorescence Quantitative PCR for Streptococcus suis Detection and Its Clinical Application

Lei Yuping,Wang Zhongbing,Yang Zhiping,Zhang Zhongping,Wang Zhiwei,Hu Mingming
(Shanxi Animal Disease Prevention and Control Center,Taiyuan,Shanxi 030027)

In order to diagnose and detect swine streptococcosis rapidly,the specific primers and Taqman probes were designed according to the conservative regional sequence of the antigen gene of Streptococcus suis(SS) in GenBank.By optimizing the reaction system and amplification conditions of real-time PCR,Taqman real-time PCR method was established,which could detect the SS quickly and accurately. The sensitivity,repeatability and specificity of this method were tested,and suspected clinical infection samples were also detected. The results showed that the sensitivity of the established Taqman FQ-PCR method was 1X102copy/μL. Three recombinant plasmids with different concentrations of SS were amplified 3 times,and the variation coefficient was less than 3%,which showed good repeatability. The specific test showed that only the amplification curve of SS was positive and the other pathogens had no fluorescent signal. Thirty samples of suspected SS infection were detected by this method,and 27 samples were tested positive,which was more sensitive than the national standard. In conclusion,the FQ-PCR method was sensitive,reproducible and specific,which was beneficial to the rapid diagnosis and detection of SS.

fluorescence quantitative PCR;Streptococcus suis;detection;probe

S852.61

A

1005-944X(2017)12-0084-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.024

山西省重點研發(fā)計劃一般項目(201603D221023-3)