李桂梅,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109)

動物用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染檢測

李桂梅,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東青島 266109)

為掌握動物用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的污染情況,抽取16份市售動物用疫苗,分別采用ELISA和熒光定量RT-PCR檢測病毒抗原和核酸.結(jié)果顯示,ELISA檢測中有2份(豬瘟疫苗)為陽性,熒光定量RT-PCR檢測均為陰性.結(jié)果表明,我國獸用疫苗中的BVDV污染水平較低,但不容忽視.

疫苗;牛病毒性腹瀉病毒;病毒污染檢測;ELSA;熒光定量RT-PCR

牛病毒性腹瀉病,又稱牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease,BVD/MD),是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛潰瘍,以及懷孕母牛流產(chǎn)等繁殖障礙為主要特征的傳染病,導(dǎo)致牛生產(chǎn)性能下降,嚴(yán)重危害牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[1].因此,許多國家都采取積極措施來控制BVD流行.BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae),與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和邊界病毒(Border disease virus,BDV) 同為瘟病毒屬成員.它們之間具有抗原相關(guān)性,在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)[2]. 根據(jù)BVDV 病毒基因組5′-UTR序列的不同,BVDV可 分 為BVDV I型(BVDV-1) 和BVDV II型(BVDV-2)[3].

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,細(xì)胞培養(yǎng)在生命科學(xué)及生物制品研究中的作用起到越來越重要.BVDV作為牛血清中最常見的外源病毒污染物,會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4].在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,如果使用了被BVDV 污染的犢牛血清,一方面會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,另一方面,疫苗在制備過程中會受到污染,導(dǎo)致疫苗接種動物發(fā)病或死亡.對豬群進(jìn)行豬瘟免疫接種是預(yù)防豬瘟的有效措施.目前豬瘟疫苗主要由豬瘟兔化弱毒株通過牛睪丸細(xì)胞增殖培養(yǎng)而制成.一旦供應(yīng)睪丸細(xì)胞的牛只感染了BVDV,就會造成豬瘟疫苗的BVDV污染.豬群接種了受污染的疫苗,就會發(fā)生類似豬瘟的癥狀,導(dǎo)致接種豬發(fā)病或死亡.Wensvoort 等[5]最早報道了因接種污染BVDV的豬瘟疫苗而導(dǎo)致豬群感染的事件.除此之外,BVDV感染可對豬瘟疫苗的免疫效果產(chǎn)生重要影響:一方面可抑制豬瘟抗體產(chǎn)生,另一方面可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量針對BVDV的抗體而使有效免疫原量減少,從而導(dǎo)致免疫失敗[6].

為掌握我國動物用疫苗中的BVDV污染情況,本研究抽取16份市售動物用疫苗,分別進(jìn)行ELISA和熒光定量RT-PCR檢測.

1 材料與方法

1.1 疫苗

16份動物用疫苗均為市面所售,編號為1～16.其中,豬用疫苗5種,禽用疫苗4種.生產(chǎn)廠家編號為A～H.除H為國外企業(yè)外,其余均為國內(nèi)動物疫苗生產(chǎn)企業(yè).疫苗信息見表1.

表1 疫苗信息

1.2 試劑

牛病毒性腹瀉病毒ELISA檢測試劑盒(IDEXX BVDV Ag/Serum Plus Test):購自IDEXX公司(美國);QIAamp viral RNA 提取試劑盒以及QuantiTect probe RT-PCR:購自Qiagen(美國).

1.3 引物合成

參照已發(fā)表文獻(xiàn)[7]設(shè)計引物及探針,交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表2).

1.4 ELISA

按照IDEXX試劑說明書要求進(jìn)行.

1.5 熒光定量RT-PCR

使用QIAamp viral RNA提取試劑盒(Qiagen),按說明提取病毒RNA,并保存于-80 ℃,備用.使用一步法熒光定量RT-PCR,擴(kuò)增病毒RNA.反應(yīng)總體系25 μL,包括2 XRT-PCR Master mix(HotStarTaq DNA polymerase 和4 mmol/L MgCl2)12.5 μL、RT mix(Omniscript 和 Sensiscript reverse transcriptase)0.5 μL、上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL、熒光探針(10 μmol/L)FAM(BVDV-1)和 TxR(BVDV-2)0.25 μL、RNA 模板 5 μL、滅菌雙蒸水5.75 μL.使用羅氏LightCycler熒光定量PCR儀,進(jìn)行熒光定量PCR儀擴(kuò)增.反應(yīng)程序如下:50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min,94 ℃預(yù)變性,以及滅活反轉(zhuǎn)錄酶15 min,94 ℃變性15 s,退火和延伸60 ℃ 1 min,設(shè)置40個循環(huán).

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測

對16份國內(nèi)市場銷售的動物用疫苗,用BVDV抗原ELISA檢測方法進(jìn)行檢測.結(jié)果顯示:檢出2份BVDV陽性樣品(8、10號),其余均為陰性;2份BVDV陽性樣本均為細(xì)胞源豬瘟疫苗,分別來自于國內(nèi)兩個疫苗生產(chǎn)廠家(A、E).

2.2 熒光定量RT-PCR檢測

所有樣本中均未有檢出BVDV核酸.

3 討論

BVDV呈世界性分布,不僅可以感染牛,也可感染豬、綿羊、山羊、鹿和其他反芻動物,一旦暴發(fā)流行,很難被有效控制和消滅,會給各國畜牧業(yè)帶來深遠(yuǎn)影響.此外,它能夠污染生物制品,并可通過生物制品傳播,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失.因此,對用于生產(chǎn)疫苗的一些材料和制成品,必須進(jìn)行嚴(yán)格BVDV檢測,在排除BVDV污染后方可使用.對于BVDV檢測,病毒分離是最準(zhǔn)確的方法.但病毒分離耗時較長,結(jié)果獲取比較慢.而ELISA方法以其快速、靈敏、簡單并便于同時檢測大量樣品等優(yōu)點(diǎn)而深受人們歡迎,成為最常規(guī)的檢測方法,已被多個國家應(yīng)用于BVDV檢測[8].由于BVDV與CSFV在抗原上的相關(guān)性,ELISA方法也可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果.本研究在ELISA檢測的同時,進(jìn)行了病毒核酸檢測,最大限度保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.

據(jù)報道,BVDV在我國牛群中的感染率很高.2010 年研究人員對30 個規(guī)模牛場進(jìn)行了BVDV抗體抽檢,發(fā)現(xiàn)陽性率高達(dá)80%以上[9].這表明BVDV在我國牛群中普遍存在.關(guān)于疫苗中的BVDV污染檢測情況,國內(nèi)也有報道.2012年葉兆美[10]對10 份豬瘟活疫苗樣品和9 份藍(lán)耳病活疫苗樣品進(jìn)行了BVDV核酸檢測,證實(shí)有2份呈BVDV陽性,污染率為10.53%.范學(xué)政等[11]通過RT-PCR手段,檢測了23個批次的豬瘟細(xì)胞苗,證實(shí)BVDV陽性率為21.74%. 本研究通過ELISA和RT-PCR手段,對16份市售動物疫苗中的BVDV污染情況進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)有2份細(xì)胞源豬瘟疫苗呈BVDV抗原陽性,熒光定量RT-PCR核酸檢測結(jié)果均為陰性.由于CSFV與BVDV在血清學(xué)存在交叉反應(yīng)性,ELISA檢出陽性可能是由于交叉反應(yīng)引起的.

4 結(jié)論

本研究對16份市售商品化動物疫苗中BVDV污染情況進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)有2份豬瘟疫苗呈現(xiàn)BVDV抗原陽性,核酸檢測均為陰性.檢測結(jié)果提示:我國動物疫苗中存在BVDV污染;對其污染的控制,不容忽視;各科研單位和疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)不斷加強(qiáng)所用血清的BVDV污染檢測,以保障我國生物制品安全.

[1] 朱禮倩,周艷君,于海,等. 牛病毒性腹瀉在中國的流行現(xiàn)狀分析[J]. 中國動物傳染病學(xué)報,2011,19(5):83-86.

[2] TAO J,LIAO J,WANG Y,et al. Bovine viral diarrhea virus(BVDV)infections in pigs[J]. Veterinary microbiology,2013,165(3/4):185-189.

[3] RIDPATH J F,BOLIN S R,DUBOVI E J. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes[J]. Virology,1994,205(1):66-74.

[4] 張志,張美晶,董雅琴,等. 豬用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染的檢測與分析[J]. 中國動物檢疫,2015,32(11):76-79.

[5] WENSVOORT G,TERPSTRA C. Bovine viral diarrhea virus infections in piglets born to sows vaccinated against swine fever with a contaminated vaccines[J]. Research in veterinary science,1988,45(2):143-148.

[6] 毛曉娜,繆芬芳,季偉. 牛病毒性腹瀉病毒在豬瘟疫苗中的污染情況及其檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2013,40(2):175-179.

[7] BAXI M,MCRAE D,BAXI S,et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses[J].Veterinary microbiology,2006,116(1/2/3):37-44.

[8] 童欽,霍志云,胡桂學(xué),等. 牛病毒性腹瀉病毒檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(14):79-83.

[9] 黃凱,張俊杰,劉英霞,等. 北京地區(qū)規(guī)?；鯞VDV持續(xù)感染牛清除方案的初步實(shí)施[J]. 中國動物檢疫,2010. 27(5):34-35.

[10] 葉兆美. 豬瘟和藍(lán)耳病疫苗中BVDV和PCV污染情況調(diào)查[J]. 四川畜牧獸醫(yī),2012 (3):32-33.

[11] 范學(xué)政,寧宜寶,王琴,等. 用RT-PCR方法檢測豬瘟細(xì)胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2010,46(1):8-10.

(責(zé)任編輯:朱迪國)

BVDV Contamination Detection in Animal Vacci nes

Li Guimei,Shan Hu
(College of Animal Science and Veterinary,Qingdao Agricultural University, Qingdao,Shandong 266109)

To investigate the contamination situation of Bovine virus diarrhea virus(BVDV)in animal vaccines,16 animal vaccines were collected. ELISA and fluorescence quantitative RT-PCR test were carried out to detect the virus antigen and nucleic acid,respectively. The results showed that 2 CSF vaccines were positive by ELISA and all samples were negative by fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that the BVDV contamination in animal vaccines in China was at a relatively low level,but it still could not be ignored.

vaccine;BVDV;virus contamination detection;ELISA;fluorescence quantitative RT-PCR

S851.34+7

B

1005-944X(2017)12-0078-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.022

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃(2016YFD0501100);中國-波蘭科技合作委員會第36屆例會項(xiàng)目(36-11)

單 虎