車 佳

白藜蘆醇對TRAIL耐藥HT29細胞的干預(yù)作用及機制研究

車 佳

目的 探討白藜蘆醇是否能提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性并研究其機制。方法 將TRAIL耐藥HT29細胞（TR-HT29細胞）按對照組、白藜蘆醇組、TRAIL組、白藜蘆醇+TRAIL組及白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組進行分組后，CCK-8法檢測TR-HT29細胞活力，流式細胞術(shù)檢測TR-HT29細胞的凋亡程度和線粒體膜電位，Western blot實驗檢測TR-HT29細胞HAX-1表達水平、細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化。結(jié)果 TR-HT29細胞對TRAIL的半數(shù)有效濃度（IC50）（19.4±1.3）ng/mL 顯著高于 HT29 細胞的（1.8±0.2）ng/mL，（P＜0.05）。白藜蘆醇處理可顯著抑制TR-HT29細胞HAX-1蛋白的表達水平。白藜蘆醇+TRAIL組TR-HT29的細胞活力抑制率（53.6±4.4）%，凋亡誘導(dǎo)率（39.4±2.9）%，顯著高于TRAIL組的細胞活力抑制率[（14.3±1.0）%，P＜0.05]、凋亡誘導(dǎo)率[（9.6±0.7）%，P＜0.05]和白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組的細胞活力抑制率[（19.9±1.5）%，P＜0.05]、凋亡誘導(dǎo)率[（13.8±1.1）%，P＜0.05]。白藜蘆醇+TRAIL組TR-HT29的線粒體膜電位顯著低于TRAIL組和白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組。白藜蘆醇+TRAIL組TR-HT29細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化顯著高于TRAIL組和白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組。結(jié)論白藜蘆醇通過下調(diào)HAX-1表達提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性。

結(jié)直腸癌；TRAIL；白藜蘆醇；HAX-1；凋亡

TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis- inducing ligand，TRAIL）是一種由巨噬細胞分泌的細胞因子，能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡而不影響正常細胞的功能，因此TRAIL是一種很有前景的抗腫瘤藥物[1]。然而腫瘤細胞對TRAIL的獲得性耐藥嚴(yán)重降低了它的抗腫瘤療效[2]。本研究的目的在于探討白藜蘆醇是否能提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性并研究其機制。

1 實驗材料

1.1 試 劑 TRAIL（批號P50591）購于美國Ramp;D system公司。白藜蘆醇（批號R5010）、細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8，批號 96992）、凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）購于美國Sigma-Aldrich。HCLS1 相關(guān)蛋白-1（HCLS1 associated protein X-1，HAX-1，批號 sc-28268）、細胞色素 c（批號sc-13560）、活化半胱天冬酶（活化 caspase-3，批號sc-22171）和 β-肌動蛋白（β-actin，批號 sc-1615）抗體購于美國Santa Cruz公司。增強型化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescence，ECL） 試 劑 盒 （批 號32106）購于美國Pierce公司。細胞線粒體分離試劑盒（批號C3601）購于江蘇碧云天生物科技有限公司。pcDNA3.1（批號V79020）和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000，批號 11668019）購于美國Invitrogen 公司。線粒體膜電位染料 JC-1（5，5，6，6-tetrachloro-1，1，3，3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide，批號65-0851-38）購于美國Molecular Probes公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 本研究2014年12月—2016年11月完成于本院實驗室。人結(jié)直腸癌細胞系HT29購于中科院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中并通入5%CO2。細胞每2～3天傳代一次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)并用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次，將細胞懸液按1：3稀釋后傳代。TRAIL耐藥HT29（TR-HT29）細胞用TRAIL梯度暴露法進行誘導(dǎo)構(gòu)建，簡要步驟如下：首先將HT29細胞用含0.1ng/mL的TRAIL的培養(yǎng)基培養(yǎng)10周，之后每3周將TRAIL濃度提高0.02ng/mL，最終使HT29細胞穩(wěn)定培養(yǎng)在含0.3ng/mL TRAIL的培養(yǎng)基中。在進行實驗前，先將TR-HT29細胞置于不含TRAIL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周，以消除殘余TRAIL對實驗的影響。

2 實驗方法

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將HAX-1基因的開放閱讀框架序列以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成HAX-1重組真核表達質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將2μg/mL HAX-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入TR-HT29細胞中，培養(yǎng)24h。

2.2 TRAIL半數(shù)有效濃度（IC50）的測定 將HT29或TR-HT29細胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜，分為HT29細胞組和TR-HT29細胞組。兩組細胞用不同濃度的TRAIL處理48h后進行CCK-8細胞活力檢測實驗，根據(jù)CCK-8細胞活力實驗結(jié)果計算TRAIL對HT29細胞和TR-HT29細胞的IC50。

2.3 CCK-8細胞活力檢測實驗 將TR-HT29細胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜。實驗分為對照組、白藜蘆醇組、TRAIL組、白藜蘆醇+TRAIL組及白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組。對照組為TRHT29細胞用生理鹽水處理48h，白藜蘆醇組為TRHT29細胞用10μmol/L白藜蘆醇處理48h，TRAIL組為TR-HT29細胞用5ng/mL TRAIL處理48h，白藜蘆醇+TRAIL組為TR-HT29細胞用10μmol/L白藜蘆醇+5ng/mL TRAIL處理48h，白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組為TR-HT29細胞用10μmol/L白藜蘆醇+5ng/mL TRAIL+2μg/mL HAX-1質(zhì)粒處理 48h。在經(jīng)過藥物處理的TR-HT29細胞培養(yǎng)體系中加入20μL的CCK-8試劑并在37°C下培養(yǎng)2h，培養(yǎng)后將96孔板用450nm波長的酶標(biāo)儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

2.4 細胞凋亡實驗 將TR-HT29細胞按上述進行分組處理，之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術(shù)檢測TR-HT29細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

2.5 細胞線粒體膜電位檢測 將TR-HT29細胞按上述進行分組處理，處理完畢后將細胞用JC-1試劑孵育20min。之后將細胞用生理鹽水離心洗滌5次并用流式細胞儀進行檢測。JC-1能聚集在正常線粒體并發(fā)出紅色熒光，若線粒體膜電位降低則JC-1不能聚集在線粒體中，因此紅色熒光越強表明細胞線粒體膜電位越高。

2.6 線粒體分離 將TR-HT29細胞按上述進行分組處理，之后用細胞線粒體分離試劑盒按照試劑操作說明書步驟將TR-HT29細胞的線粒體分離出來，細胞質(zhì)進行Western blot實驗用于檢測細胞色素C的釋放。

2.7 Western blot實驗 將TR-HT29細胞按上述進行分組處理，之后將細胞用細胞裂解液進行裂解，提取總蛋白質(zhì)（或線粒體分離試劑盒分離出的細胞質(zhì)）進行Western blot實驗。樣品用12%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用HAX-1、細胞色素C、活化caspase-3和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇提高TR-HT29細胞對TRAIL的敏感性 測定HT29細胞和TR-HT29細胞對TRAIL的敏感性，結(jié)果顯示TRAIL對TR-HT29細胞的IC50顯著高于HT29細胞（見表1），表明TR-HT29細胞有明顯藥物抵抗性。將TR-HT29細胞用白藜蘆醇和TRAIL進行體外處理，CCK-8實驗結(jié)果顯示聯(lián)合白藜蘆醇后，TRAIL對TR-HT29的細胞活力抑制率顯著提高；流式細胞實驗結(jié)果顯示白藜蘆醇也同樣能顯著增強TRAIL對TR-HT29細胞的凋亡誘導(dǎo)活性（見表2），表明白藜蘆醇能提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性。Western blot實驗結(jié)果顯示白藜蘆醇處理能顯著抑制TR-HT29細胞中HAX-1蛋白的表達水平，而TRAIL處理對HAX-1無影響（見圖1）。在TR-HT29細胞中轉(zhuǎn)染HAX-1質(zhì)粒使之強制表達，從而對抗白藜蘆醇對HAX-1蛋白的抑制作用。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HAX-1質(zhì)粒后，白藜蘆醇對TRAIL的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)受到明顯抑制（見表2），表明白藜蘆醇是通過抑制HAX-1蛋白的表達提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL敏感性。

表1 TRAIL對HT29細胞及TR-HT29細胞IC50（±s）

表1 TRAIL對HT29細胞及TR-HT29細胞IC50（±s）

注：與HT29細胞比較，*P＜0.05

孔數(shù)細胞分組HT29細胞組TR-HT29細胞組3 3 TRAILIC50（ng/mL）1.8±0.2 19.4±1.3*

圖1 白藜蘆醇下調(diào)TR-HT29細胞HAX-1蛋白表達水平

3.2 白藜蘆醇通過下調(diào)HAX-1蛋白表達促進TRAIL對TR-HT29細胞線粒體的損傷 流式細胞結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著增強TRAIL對TR-HT29細胞線粒體的損傷，而轉(zhuǎn)染HAX-1質(zhì)粒后，白藜蘆醇聯(lián)合TRAIL的線粒體的損害效應(yīng)受到顯著抑制（見圖2），表明白藜蘆醇能通過下調(diào)HAX-1蛋白的表達促進TRAIL對TR-HT29細胞線粒體的損傷。

表2 白藜蘆醇提高TR-HT29細胞對TRAIL的敏感性（±s）

表2 白藜蘆醇提高TR-HT29細胞對TRAIL的敏感性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，與 TRAIL 組比較，amp;P＜0.05，與白藜蘆醇+TRAIL 組比較，#P＜0.05

組別對照組白藜蘆醇組TRAIL組白藜蘆醇+TRAIL組白藜蘆醇+TRAIL+HAX-1質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3細胞活力抑制率（%）0 6.9±0.5 14.3±1.0*53.6±4.4amp;19.9±1.5#凋亡誘導(dǎo)率（%）2.2±0.3 4.8±0.4 9.6±0.7*39.4±2.9amp;13.8±1.1#

圖2 白藜蘆醇通過下調(diào)HAX-1蛋白的表達促進TRAIL對TR-HT29細胞線粒體的損傷

3.3 白藜蘆醇通過下調(diào)HAX-1蛋白的表達促進TRAIL誘導(dǎo)的細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化 Western blot結(jié)果顯示白藜蘆醇能顯著增強TRAIL誘導(dǎo)的細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化，而同時轉(zhuǎn)染HAX-1質(zhì)粒后，兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的細胞色素C的釋放和Caspase-3的活化受到顯著抑制（見圖3），表明白藜蘆醇通過下調(diào)TR-HT29細胞中HAX-1蛋白的表達增強TRAIL依賴的線粒體途徑凋亡。

圖3 白藜蘆醇通過下調(diào)TR-HT29細胞中HAX-1蛋白的表達增強TRAIL依賴的細胞色素C的釋放和Caspase-3活化

4 討論

結(jié)直腸癌是一種很常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率居于全球第三位。結(jié)直腸癌的惡性程度很高，腫瘤轉(zhuǎn)移能力很強，因此結(jié)直腸癌的致死率非常高[3]。在結(jié)直腸癌的常規(guī)治療中，抗腫瘤藥物的使用是不可替代的方法，其療效在很大程度上決定了結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，然而隨著抗腫瘤藥物的持續(xù)使用，結(jié)直腸癌細胞會逐漸產(chǎn)生耐藥性[4]。因此藥物治療對耐藥結(jié)直腸癌細胞的療效很差，提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對藥物的敏感性具有十分重要的臨床意義。

TRAIL能與腫瘤細胞表面的死亡受體4或死亡受體5發(fā)生結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（deathinducing signaling complex，DISC）。這個復(fù)合物能使Caspase-8發(fā)生活化，誘導(dǎo)線粒體膜電位的降低，從而使線粒體發(fā)生損傷。受損的線粒體會大量釋放其中的細胞色素c這一強烈的凋亡誘導(dǎo)因子，最后使Caspase-3發(fā)生活化并使細胞進入凋亡程序[5-7]。由于TRAIL能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡而對正常細胞影響不大，因此，TRAIL是一種很好的抗結(jié)直腸癌藥物。然而由于重復(fù)給藥很容易造成結(jié)直腸癌細胞的獲得性藥物抵抗，因此通過輔助治療手段提高結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性，減弱獲得性藥物抵抗是提高TRAIL療效的有效方法。

白藜蘆醇是一種天然存在的多酚類藥物，對多種疾病均有良好的治療效果。近期的研究表明白藜蘆醇還有一定的抗腫瘤效應(yīng)，如能在一定程度上抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]，大劑量還可通過ROS途徑誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生凋亡[9]。然而，白藜蘆醇是否對已產(chǎn)生獲得性TRAIL耐藥的結(jié)直腸癌細胞有增敏作用，至今還未充分報道。本研究的實驗結(jié)果表明白藜蘆醇能顯著增強TRAIL對耐藥結(jié)直腸癌細胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，因此白藜蘆醇是良好的輔助抗腫瘤藥物。

HAX-1是一種定位在線粒體外膜上的抗凋亡蛋白[10]。研究表明，過表達的HAX-1能阻礙腫瘤細胞的凋亡途徑，抑制抗腫瘤藥物引起的腫瘤細胞線粒體的損傷，因此腫瘤細胞的HAX-1往往過度表達，且HAX-1的過表達程度與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性呈負相關(guān)[11]。本研究證實白藜蘆醇能下調(diào)TRAIL耐藥結(jié)直腸癌細胞中HAX-1蛋白的表達，從而促進TRAIL損傷腫瘤細胞的線粒體，釋放細胞色素C進入細胞質(zhì)進而誘導(dǎo)耐藥結(jié)直腸癌細胞發(fā)生Caspase-3依賴的凋亡。當(dāng)轉(zhuǎn)染HAX-1表達質(zhì)粒使HAX-1蛋白發(fā)生過表達后，白藜蘆醇的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)明顯減弱，表明白藜蘆醇發(fā)揮作用的機制和HAX-1蛋白的下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇能顯著提高耐藥結(jié)直腸癌細胞對TRAIL的敏感性。其機制為白藜蘆醇下調(diào)HAX-1蛋白的表達，誘導(dǎo)耐藥結(jié)直腸癌細胞在TRAIL的作用下發(fā)生線粒體途徑的凋亡。這些研究為提高結(jié)直腸癌的化療敏感性提供了新的思路和理論依據(jù)。

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Intervention of Resveratrol on the Sensitivity of Drug-resistant Colorectal Cancer Cells to TRAIL and the Underlying Mechanism

CHE Jia.
Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of resveratrol on increasing the sensitivity of drug-resistant colorectal cancer cells to TRAIL treatment and the related mechanism.Methods TRAIL-resistant HT29（TR-HT29）cells were divided into control group,resveratrol group,TRAIL group,resveratrol+TRAIL group and resveratrol+TRAIL+HAX-1 plasmid group.CCK-8 assays were applied to evaluating the cell viability of TR-HT29 cells,flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis and mitochondrial membrane potential.Western blot analysis was used to detect the release of cytochrome C and the activation of caspase-3.Results IC50 of TRAIL to TR-HT29 was significantly higher than that to HT29 cells[（19.4±1.3）ng/mL vs（1.8±0.2）ng/mL,P＜0.05].Resveratrol treatment was able to suppress the expression of HAX-1 in TR-HT29 cells.Inhibitory rate of cell viability（53.6±4.4）%and apoptotic rate（39.4±2.9）%in TRAIL+resveratrol group was significantly higher than the inhibitory rate of cell viability[（14.3±1.0）%,P＜0.05]and apoptotic rate[（9.65±0.7）%,P＜0.05]in TRAIL group and the inhibitory rate of cell viability[（19.95±1.5）%,P＜0.05]and the apoptotic rate[（13.8±1.1）%,P＜0.05]in TRAIL+resveratrol+HAX-1 plasmid group.Mitochondrial membrane potential of TR-HT29 in TRAIL+resveratrol group was significantly higher than that in TRAIL group and TRAIL+resveratrol+HAX-1 plasmid group.Release of cytochrome C and activation of caspase-3 in TRAIL+resveratrol group was significantly higher than that in the TRAIL group and TRAIL+resveratrol+HAX-1 plasmid group.Conclusion Resveratrol increased the sensitivity of drug-resistant colorectal cancer cells to TRAIL through downregulating the expression of HAX-1.

colorectal cancer;TRAIL;Resveratrol;HAX-1;apoptosis

浙江省立同德醫(yī)院檢驗科（杭州 310012）

（收稿：2017-05-17 修回：2017-06-20）