秦雯雯，王慶偉，趙 波，張生萍，許曉輝

（1甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅蘭州730070；2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西西安710038；3蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅蘭州 730000）

HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度評(píng)定

秦雯雯1，王慶偉2，趙 波3，張生萍3，許曉輝3

（1甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅蘭州730070；2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，陜西西安710038；3蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅蘭州 730000）

不確定度評(píng)定是評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確有效與否的量化指標(biāo)，本研究介紹了HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定來(lái)源、不確定評(píng)定程序以及HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度應(yīng)用進(jìn)展，為HPLC-MS法在藥品定量過(guò)程中進(jìn)行不確定度的測(cè)定評(píng)估提供參考，從而保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠．

HPLC-MS；不確定度；評(píng)定

0 引言

液質(zhì)聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析樣品不需要繁瑣的前處理，同時(shí)能夠得到化合物的保留時(shí)間、分子量、碎片結(jié)構(gòu)特征等信息，具有高效快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，適合分析含量少、無(wú)紫外吸收的化合物．HPLC-MS法作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法已應(yīng)用到藥品定性定量分析中，主要用于成分復(fù)雜，分離困難的中藥含量測(cè)定、化學(xué)藥物復(fù)合制劑主要成分定量及雜質(zhì)測(cè)定、多肽藥物定量及雜質(zhì)測(cè)定、中成藥中的化學(xué)藥品非法添加的分析、原研藥物與仿制藥生物等效性分析等方面［1-9］．在測(cè)定過(guò)程中，由于受測(cè)定所用儀器的限制、測(cè)定方法的不完善、分析操作和測(cè)定環(huán)境的變化、測(cè)定人員本身的技術(shù)水平或經(jīng)驗(yàn)的影響，被測(cè)定的真值不可能通過(guò)測(cè)定得到，而借助測(cè)定不確定度可以了解到被測(cè)定的值處于何種范圍內(nèi)，測(cè)定不確定度就是表征合理地賦予測(cè)定之值的分散性與測(cè)定結(jié)果相聯(lián)系的系數(shù)，因此測(cè)定不確定度是質(zhì)量控制部門重點(diǎn)管控范疇，為了更加準(zhǔn)確科學(xué)地應(yīng)用HPLC-MS法進(jìn)行藥品定量，測(cè)定不確定度被引入到HPLC-MS法測(cè)定過(guò)程受控檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢測(cè)方法驗(yàn)證評(píng)價(jià)、測(cè)定結(jié)果與參照值一致性檢驗(yàn)、不同測(cè)定方法之間比對(duì)等方面，其中擴(kuò)展不確定度用于測(cè)定審核結(jié)果判定，這將有效地提高含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性．

1 HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度來(lái)源

常見(jiàn)的測(cè)定不確定度一般來(lái)源有：被測(cè)對(duì)象、測(cè)定儀器、測(cè)定環(huán)境、測(cè)定人員和測(cè)定方法等．結(jié)合HPLC-MS法測(cè)定樣品的處理過(guò)程和測(cè)定過(guò)程，分析不確定度主要有以下來(lái)源：稱樣用到電子分析天平和樣品取樣的隨機(jī)性所存在的隨機(jī)誤差構(gòu)成了樣品稱樣過(guò)程中的不確定度；用來(lái)校準(zhǔn)樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線的不確定度；容量瓶定容讀取的體積引入的誤差；測(cè)定樣品在提取、濃縮、轉(zhuǎn)移過(guò)程中所引入的誤差；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所產(chǎn)生的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度；儀器的重復(fù)性和精密度引起的不確定度；儀器校準(zhǔn)及測(cè)定過(guò)程引入的不確定度；測(cè)定方法引入的不確定度．主要的測(cè)定不確定來(lái)源總結(jié)見(jiàn)圖 1［10］．

圖1 HPLC-MS法測(cè)定藥品含量不確定的來(lái)源示意圖

2 HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度評(píng)定

測(cè)定不確定度來(lái)源于測(cè)定過(guò)程和樣品處理過(guò)程，因此測(cè)定不確定度評(píng)定也緊扣這些過(guò)程，以實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能帶入的不確定度的各環(huán)節(jié)作為分量，通過(guò)比較各分量的不確定度的大小，可以量化各分量對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響程度，通過(guò)對(duì)各分量的不確定度評(píng)定，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，再由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k得到擴(kuò)展不確定度，不確定度評(píng)定的一般步驟見(jiàn)圖 2［11］．

圖2 測(cè)定不確定度評(píng)定的一般步驟

HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度評(píng)定具體步驟如下：①理解描述所有對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響的影響量．如樣品及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱樣、容量瓶定容、取樣過(guò)濾、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)絕對(duì)含量、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度、液質(zhì)聯(lián)用儀器等引入的不確定度；②建立數(shù)學(xué)模型．被測(cè)量y由N 個(gè)輸入量 x1，x2，x3，…，xN通過(guò)函數(shù)關(guān)系來(lái)確定，即 y＝f（x1，x2，x3，…， xN），在這里測(cè)定某種藥品含量按如下公式計(jì)算，X＝（C×V）／（m×fr），X 為被測(cè)定某種藥品含量，μg／kg；C為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的樣品溶液濃度，μg／L；m為樣品稱樣量，g；V為定容體積，mL；fr為回收率；③標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定．要對(duì)每一個(gè)不確定來(lái)源通過(guò)測(cè)定或估值量化，估計(jì)每一個(gè)分量對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)，排除不重要的分量，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定量、使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量、對(duì)結(jié)果進(jìn)行估值、儀器校準(zhǔn)／檢定證書(shū)提供的值、基于判斷進(jìn)行定量等方法進(jìn)行量化，標(biāo)準(zhǔn)不確定度是以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示的測(cè)定不確定度；④合成不確定度的計(jì)算．被測(cè)定的合成不確定度等于各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方和的平方根，合成不確定度是測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值，它表征了測(cè)定結(jié)果的分散性；⑤擴(kuò)展不確定度．根據(jù)要求的包含概率選定因子k，包含因子k與合成不確定度相乘得到擴(kuò)展不確定度，擴(kuò)展不確定度是指合理賦值的被測(cè)定量之值的分散區(qū)間理應(yīng)包含全部的測(cè)定值；⑥測(cè)定不確定度的符合性判斷．如圖3所示［12］，U為擴(kuò)展不確定度，2T為上下限．

圖3 測(cè)定不確定度符合性與不符合性判斷示意圖

3 HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度評(píng)定應(yīng)用進(jìn)展

HPLC-MS法測(cè)定藥品含量存在誤差，不確定度是評(píng)估測(cè)定結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)，不確定度愈小，表明測(cè)定結(jié)果與真值越接近，表示測(cè)定結(jié)果越準(zhǔn)確．HPLC-MS法在中藥定量控制方面主要應(yīng)用于成分復(fù)雜，分離困難的中藥含量測(cè)定，不確定度評(píng)定能夠?yàn)閼?yīng)用HPLC-MS法進(jìn)行中藥定量的準(zhǔn)確性提供量化指標(biāo)，進(jìn)一步保證分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠．陳建琴［13］對(duì)HPLC-MS測(cè)定川楝子中川楝素含量進(jìn)行不確定度評(píng)估，評(píng)估結(jié)果顯示，液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣重復(fù)性是測(cè)量結(jié)果不確定度的主要來(lái)源，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)結(jié)果也有影響，但是影響不大，而供試品的定容體積、取樣量、相對(duì)取樣量對(duì)結(jié)果的影響可以忽略不計(jì)．化學(xué)藥物血藥濃度檢測(cè)是進(jìn)行安全有效用藥的保證，評(píng)估HPLCMS法測(cè)定結(jié)果的不確定度能夠系統(tǒng)考察檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果的誤差范圍．王長(zhǎng)陸等［14］分析了HPLC-MS／MS法測(cè)定人血漿中6-MMP含量的不確定度來(lái)源，計(jì)算并進(jìn)行合成不確定度和擴(kuò)展不確定度，評(píng)估了HPLCMS／MS法測(cè)定6-MMP含量的不確定度，結(jié)果表明，不確定度在低濃度時(shí)主要由基質(zhì)效應(yīng)、回收率、生物樣品配制引入，而在高濃度時(shí)主要由回收率和生物樣品配制引入．在應(yīng)用HPLC-MS法測(cè)定中成藥的非法添加的不確定度評(píng)定方面，龍凌云等［15］通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型，分析不確定度來(lái)源，對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評(píng)估、計(jì)算，由此計(jì)算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度評(píng)估了HPLC-MS法測(cè)定中成藥中二甲雙胍的不確定度，該方法可用于評(píng)估測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確有效性．武利慶等［16］對(duì)直接流動(dòng)注射電噴霧質(zhì)譜法和液質(zhì)聯(lián)用電噴霧法測(cè)定牛血清蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定不確定度進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果表明，液質(zhì)聯(lián)用法不確定度低，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性高，這是由于測(cè)定樣品經(jīng)過(guò)液質(zhì)聯(lián)用的色譜柱的分離和脫鹽，雜質(zhì)對(duì)分子量測(cè)定的影響變?。偟膩?lái)說(shuō)，HPLC-MS法測(cè)定藥品含量的不確定度評(píng)定可以有效控制測(cè)定過(guò)程中的誤差風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)然HPLC-MS法測(cè)定目標(biāo)物不同、儀器參數(shù)不同、被測(cè)定物的重現(xiàn)性不同、甚至不同測(cè)定時(shí)間都會(huì)產(chǎn)生不同的誤差，因此不確定度的評(píng)定是一件比較困難的事情．

4 結(jié)語(yǔ)

HPLC-MS法越來(lái)越多地被應(yīng)用于藥品定性、定量分析中，其作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法已被引入國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)中，測(cè)定過(guò)程與前處理過(guò)程往往會(huì)對(duì)其測(cè)定結(jié)果造成影響，導(dǎo)致結(jié)果偏離準(zhǔn)確有效，因此進(jìn)行不確定度評(píng)估是驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確有效的方法．由一些HPLC-MS定量不確定度評(píng)定的文獻(xiàn)報(bào)道［13-17］可以看出，測(cè)定的重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對(duì)不確定度影響最大，這提示我們樣品與對(duì)照必須同條件同法處理，同時(shí)測(cè)定，另外要保證樣品溶液濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的影響，同時(shí)由于基質(zhì)效應(yīng)有時(shí)還需要進(jìn)行回收率驗(yàn)證．這給我們的提示是，在定量分析過(guò)程中，重點(diǎn)關(guān)注前處理、天平、移液管、定容、對(duì)照、儀器等引入的不確定度，根據(jù)稱樣的要求選擇合適的天平，定期對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、儀器設(shè)備進(jìn)行期間核查，保證測(cè)定結(jié)果始終能夠保持良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性．

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Uncertainty evaluation on determination of drug content by HPLC-MS

QIN Wen-Wen1， WANG Qing-Wei2， ZHAO Bo3， ZHANG Sheng-Ping3，XU Xiao-Hui31Gansu Institute for Drug Control， Lanzhou 730070， China；2Department of Pharmacy of Tangdu Hospital，The Fourth Military Medical University， Xi'an 710038， China；3Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730000， China

Uncertainty evaluation is to evaluate the validity of measurement results．In this paper， the source of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS，the assessment procedures of uncertainty for determination of drug content by HPLCMS，and application progress of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS in quantitative detection field were introduced，it provides reference for evaluation of uncertainty for determination of drug content by HPLC-MS during drug quantitative process， so as to ensure the accuracy of the measurement results．

HPLC-MS； uncertainty； evaluation

R917

A

2095-6894（2017）11-90-03

2017-03-12；接受日期：2017-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272175）

秦雯雯．碩士．研究方向：藥品檢驗(yàn)方法．

E-mail：qinwenwen1989＠ 163．com

許曉輝．碩士．研究方向：藥品檢驗(yàn)方法．

E-mail：aiwosuozuo＠ 163．com