馮冠英，宋曉雪，徐志立，欒澤柱，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

黃秋葵對糖尿病小鼠的降血糖作用

馮冠英，宋曉雪，徐志立，欒澤柱，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的：探究黃秋葵水提液對糖尿病小鼠的治療作用及作用機制．方法：用四氧嘧啶進(jìn)行糖尿病小鼠造模；用黃秋葵水提物對糖尿病小鼠進(jìn)行灌胃，考察糖尿病小鼠的血糖變化．利用分子對接方法，考察黃秋葵所含成分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用．結(jié)果：黃秋葵水提液能夠降低糖尿病小鼠的血糖（P≤0．01），并呈一定劑量依賴性．黃秋葵中所含甾醇類成分可與α-葡萄糖苷酶穩(wěn)定結(jié)合，其中有5個化合物與α-葡萄糖苷酶結(jié)合自由能在-9．9 kcal／mol以下．結(jié)論：黃秋葵水提液能夠有效降低糖尿病小鼠的血糖，其作用機制可能是其中所含的甾醇類成分抑制α-葡萄糖苷酶的活性．

黃秋葵；糖尿病；水提物；降糖作用

0 引言

黃秋葵（Hibiscus esculentus L．），又名秋葵，是錦葵科秋葵屬一年生草本植物．黃秋葵的種植起源于非洲，具有悠久的栽培歷史．20世紀(jì)90年代初，黃秋葵被引入我國，現(xiàn)在全國各地均有栽培．黃秋葵是一種具有較高經(jīng)濟價值的蔬菜，其果實、莖、葉、花、種子都具有一定的開發(fā)利用價值．黃秋葵含有豐富的粘性糖蛋白、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)和黃酮類化合物，既可以作為高檔蔬菜，又可以開發(fā)成新型的保健食品．研究［1］表明黃秋葵果實具有豐富的營養(yǎng)和多種保健作用．楊毅等［2］通過小鼠負(fù)重力竭游泳實驗發(fā)現(xiàn)黃秋葵水提物具有良好的抗疲勞作用．據(jù)報道［3］，黃秋葵多糖對人體腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用．另有研究［4］表明黃秋葵總黃酮類成分在體外具有抗氧化作用．

世界衛(wèi)生組織和國際糖尿病聯(lián)盟［5］預(yù)測，到2025年全球?qū)⒂?．99～3．8億糖尿病患者．越來越多的流行病學(xué)資料表明，新增患者主要集中在中國、印度等發(fā)展中國家．糖尿病與冠心病、腫瘤已成為當(dāng)前影響人類健康的三大非傳染性疾病．目前，糖尿病在治療上主要有注射胰島素、口服磺酰脲類和雙胍類降糖藥物等，但是這些藥物都不同程度地存在一定的副作用［6］．此外，糖尿病在醫(yī)療和生活質(zhì)量方面的高昂代價亦使得人們越來越關(guān)注糖尿病的替代療法，利用植物中天然成分來改善及調(diào)節(jié)糖尿病患者的病情，已成為現(xiàn)階段研究的熱點問題之一．因此，從天然產(chǎn)物中尋找和開發(fā)高效低毒的治療糖尿病的藥物，具有重要意義．

張靈敏等［7］研究表明黃秋葵可以降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂水平．民間也有人發(fā)現(xiàn)食用黃秋葵果實具有一定的降糖作用，但也有人對此存疑．本研究通過糖尿病小鼠動物實驗，進(jìn)一步明確黃秋葵的降糖作用；并利用分子對接方法，對黃秋葵降糖的活性成分和作用機制進(jìn)行了初步研究，為黃秋葵作為保健食品的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1．1 材料和儀器 黃秋葵購自山東煙臺，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翟延君教授鑒定為錦葵科秋葵屬植物黃秋葵．4周齡SPF級昆明種小鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g；嚙齒動物基礎(chǔ)飼料（粉狀），購自遼寧省實驗動物資源中心，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（遼）2015-0001；四氧嘧啶（Alloxan，美國 Sigma公司）；鹽酸二甲雙胍緩釋片（山東司邦得制藥有限公司）；血糖試紙及測試儀（三諾生物傳感股份有限公司）；電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀．

1．2 實驗方法

1．2．1 黃秋葵的制備 取新鮮黃秋葵果實，洗凈切成小塊狀，粉碎機粉碎得質(zhì)量為189．97 g的黃秋葵勻漿．按照1∶5的料液比加入去離子水950 mL進(jìn)行浸提，浸提15 h．將得到的浸提液分別稀釋和濃縮1倍，作為低濃度和高濃度樣品，原提取液作為中濃度樣品，冷藏備用．

1．2．2 糖尿病動物模型的建立及分組 試驗分空白對照組、模型對照組、陽性對照組、高濃度組、中濃度和低濃度組共6組．購回的小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分成兩組，一組為空白對照組（n＝6），另一組為糖尿病造模組．糖尿病造模組小鼠于禁食12 h后腹腔注射四氧嘧啶致糖尿病，四氧嘧啶造模用量分別170 mg／kg，60 mg／kg，因血糖值未完全升高，4 d 后按用量 80 mg／kg，160 mg／kg 繼續(xù)給藥，空白對照組注射等體積生理鹽水．72 h后稱重、斷尾采血，測空腹血糖值．以血糖值＞10 mmol／L作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，除去空白對照組（n＝6）及血糖值未達(dá)標(biāo)小鼠，成模率為59．3%．按照血糖值均衡原則將造模成功小鼠分成5組，每組10只．

1．2．3 黃秋葵的降糖作用 隨機分組后次日開始每天用相應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃，分為黃秋葵高、中、低三個濃度組，陽性對照藥為二甲雙胍，空白對照組則用等體積生理鹽水灌胃，灌胃量為 0．1 mL／10 g，共 15 d．灌胃結(jié)束后，禁食12 h，斷尾取血測其血糖值，每日觀察記錄小鼠進(jìn)食、飲水、尿量及皮毛、活動等情況．

1．2．4 活性成分的虛擬篩選 根據(jù)文獻(xiàn)［8］報道，收集黃秋葵中已知化學(xué)成分61個，建立化合物數(shù)據(jù)集．從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫下載得到α-葡萄糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)（3TOP．PDB）［9］．利用 Autodock Tool軟件完成對蛋白晶體結(jié)構(gòu)的處理，去掉結(jié)晶水，加上極性氫原子，并給所有原子加電荷．對于數(shù)據(jù)集中的化合物作類似的處理，保存成pdbqt格式．根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)中原有配體的位置，確定活性位點的中心位置為（-30．97 ?，36．36 ?，25．01 ?），網(wǎng)格盒子（Grid Box）大小設(shè)置為20 ?×20 ?×20 ?．分子對接用 Autodock Vina［10］軟件實現(xiàn)，其余參數(shù)均采用缺省值．

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19．0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（least significant difference， LSD），P＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 黃秋葵對糖尿病小鼠血糖及體質(zhì)量的影響 模型組小鼠的血糖均達(dá)到了10．74 mmol／L以上，顯著高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0．01），且小鼠精神萎靡，活動明顯減少，皮毛干燥粗糙而稀疏，具有多飲、多尿的癥狀．模型組小鼠的平均體質(zhì)量明顯低于空白對照組小鼠的體質(zhì)量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0．01），說明糖尿病小鼠模型造模成功．在灌胃15 d后，給藥組小鼠的血糖較模型對照組至少低 3 mmol／L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0．05），說明黃秋葵水提物能夠在一定程度上降低糖尿病小鼠的血糖，降糖效果和陽性藥物二甲雙胍具有一定可比性．其中，高劑量組灌胃前后降糖作用最顯著（P≤0．01），說明黃秋葵降糖存在一定的量效關(guān)系．灌胃15 d后小鼠體質(zhì)量均有所增加，但空白對照組、給藥組與模型對照組相比體質(zhì)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0．01，表1），說明黃秋葵可以改善小鼠的糖尿病癥狀．

表1 糖尿病小鼠的空腹血糖值變化

2．2 黃秋葵對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 分子對接計算結(jié)果表明，所考察的黃秋葵中包含61種化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合自由能均處于-10．2和-7．1 kcal／mol之間，說明這些成分對于 α-葡萄糖苷酶具有不同程度的抑制作用．從化合物的種類來看，結(jié)合能較低的以甾醇類化合物為主．我們給出了5個代表性甾醇類化合物的結(jié)合自由能及抑制常數(shù)（表2）．這些物質(zhì)的結(jié)合自由能比較接近，最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮（-10．2 kcal／mol） 與最高的 β-谷甾醇（-9．9 kcal／mol）僅差了-0．3 kcal／mol．我們也給出了這五個活性物質(zhì)與葡萄糖苷酶的結(jié)合構(gòu)象（圖1）．從中可以看出，α-葡萄糖苷酶的活性位點具有較強的疏水性（圖中灰色區(qū)域）．這五個甾醇類化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合構(gòu)象十分類似，即均將疏水的一端插入空腔的內(nèi)部，而含有親水的羰基或羥基的暴露在外面．對結(jié)合能最低的豆甾-4-烯-3，6-二酮與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式作了進(jìn)一步分析（圖2）．可以看出，豆甾-4-烯-3，6-二酮利用自身的疏水性與在α-葡萄糖苷酶的活性位點的一些疏水性殘基，包括PHE1559，PHE1560、TYR1251、TRP1355、TRP1369 等形成疏水相互作用．值得指出的是，豆甾-4-烯-3，6-二酮中6位的羥基作為氫鍵受體與ARG1460上的胍基形成氫鍵相互作用，而其余四個化合物與α-葡萄糖苷酶之間則不存在這種強相互作用．這也許是豆甾-4-烯-3，6-二酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用稍強的原因．

表2 化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)

圖1 甾醇類化合物與α-葡萄糖苷酶的對接構(gòu)象

圖2 豆甾-4-烯-3，6-二酮與α-葡萄糖苷酶作用模式分析

3 討論

化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)糖尿病動物模型是應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)損傷胰腺β細(xì)胞，從而引發(fā)動物的糖尿?。壳俺Ｓ盟幬镉墟滊寰睾退难踵奏ぃ?1］．由于四氧嘧啶能夠快速成模，在小鼠糖尿病模型中比較常用，故本研究采用四氧嘧啶造模．對于糖尿病小鼠模型，經(jīng)過15 d的灌胃后，通過測定小鼠的空腹血糖值發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠血糖較模型組均有所降低（P≤0．05），據(jù)此推斷黃秋葵有一定的降糖作用．此結(jié)果與張靈敏等［7］的研究結(jié)果基本一致．利用分子對接方法，以α-葡萄糖苷酶為靶標(biāo)，我們對黃秋葵中所含的化學(xué)成分進(jìn)行了篩選．結(jié)果表明黃秋葵中甾醇類成分對α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用．這說明抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低小鼠的糖吸收，是黃秋葵發(fā)揮降糖作用的可能機制之一．Sabitha等［12］曾研究了黃秋葵種皮和種子粉末對抗糖尿病和抗高血脂的生理活性，其中活性物質(zhì)主要是由半乳聚糖、阿拉伯聚糖、果膠類多糖及少量糖蛋白組成的混合物．果膠類多糖為可溶性纖維，能夠降低血糖，提高胰島素敏感性［13-14］．有研究［15］表明，多糖在恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能的同時，對于改善糖代謝，抑制肝糖輸出起著極為重要的作用，并能修復(fù)受損的胰島組織與肝組織細(xì)胞．由此推測，黃秋葵的降糖作用應(yīng)該是多組分多靶點協(xié)同作用的結(jié)果．

4 結(jié)語

本研究以小鼠糖尿病模型為研究對象，結(jié)果表明黃秋葵水提物可以降低糖尿病小鼠的血糖，改善小鼠多飲、多食、多尿等癥狀．分子對接結(jié)果表明，黃秋葵中的甾醇類成分可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，是黃秋葵降糖作用的可能機制之一．我們的研究結(jié)果證實，黃秋葵具有一定的降糖作用，值得進(jìn)一步開發(fā)．

［1］薛志忠，劉思雨，楊雅華．秋葵的應(yīng)用價值與開發(fā)利用研究進(jìn)展［J］．保鮮與加工，2013，13（2）：58-60．

［2］楊 毅，金祖漢，毛培江，等．黃秋葵提取物抗疲勞的實驗研究［J］．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（12）：1091-1094．

［3］任丹丹，陳 谷．黃秋葵多糖組分對人體腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用［J］．食品科學(xué)，2010，31（21）：353-356．

［4］劉愛敬，廖爭爭，郭 琳，等．大孔樹脂純化黃秋葵黃酮及其體外抗氧化活性研究［J］．食品工業(yè)科技，2015，36（16）：284-288．

［5］劉國良．糖尿病診斷治療的最新進(jìn)展［J］．中國實用內(nèi)科雜志，2000，20（1）：29-32．

［6］謝立凱，齊晨蕊，孫亞東．糖尿病治療藥物的研究進(jìn)展［J］．中國實用醫(yī)藥，2015（21）：279-280．

［7］張靈敏．黃秋葵水提物對Ⅱ型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響［J］．食品工業(yè)科技，2015，37（3）：355-363．

［8］郭明明．黃秋葵乙酸乙酯部位和正丁醇部位化學(xué)成分研究［D］．鄭州：鄭州大學(xué)，2012．

［9］ Ren L， Qin X， Cao X， et al．Structural insight into substrate specificity of human intestinal maltase-glucoamylase［J］．Protein Cell，2011，2（10）：827-836．

［10］ Trott O， Olson AJ．AutoDock Vina： improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function，efficient optimization and multithreading［J］．J Comput Chem，2010，31（2）：455-461．

［11］艾 靜，郭 健，張永春，等．四氧嘧啶大鼠高血糖的實驗研究［J］．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，35（2）：94-96．

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［13］孫元琳，湯 堅．果膠類多糖的研究進(jìn)展［J］．食品與機械，2004，20（6）： 60-63．

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The hypoglycemic action of oksa on diabetic mice

FENG Guan-Ying， SONG Xiao-Xue， XU Zhi-Li， LUAN Ze-Zhu，ZHANG Ming-Bo
Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China

AIM： To investigate the effect of water extract of oksa on diabetes mellitus（DM） model mice and the underlying mechanism．METHODS： The diabetic mice model was established by feeding alloxan；The diabetic mice was fed with water extract of oksa once a day；Then the variations in the blood glucose of the model mice was measured daily．The inhibitors of α-glucosidase contained in oksa was screened with molecular docking method．RESULTS： Water extract of oksa can reduce the concentration of blood glucose of model mice （P≤0．01） in a dose-dependant way．Sterol ingredients contained in oksa can stabilize with α-glucocidase， among which there are five compounds with binding free energies lower than-9．9 kcal／mol．CONCLUSION：Oksa may play a role in reducing the blood glucose of model mice in which α-glucocidase activity was inhibited by its sterol ingredients．

oksa； diabetes； water extract； hypoglycemic action

R285．5

A

2095-6894（2017）11-44-04

2017-05-30；接受日期：2017-06-18

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新項目（201510162000020）

馮冠英．研究方向：保健食品．

E-mail：fengguanying＠ 126．com

張明波．博士，副教授．研究方向：藥物虛擬篩選和中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)．E-mail：mbzhang＠ 126．com