李翔

摘要：介紹了一種新型誘變育種技術(shù)——等離子體誘變育種。首先對(duì)等離子體誘變的機(jī)理作了詳細(xì)地闡述；其次分析了氣體組分、氣壓、功率、氣流速率和誘變時(shí)間五個(gè)影響等離子體誘變的主要外界因素；最后簡(jiǎn)單論述了在生物學(xué)領(lǐng)域中，等離子體誘變?nèi)〉玫某晒⒄雇鋺?yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：誘變；等離子體；活性氧自由基；微生物育

中圖分類號(hào)：TB文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.19311/j.cnki.16723198.2017.35.093

等離子體是除固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)之外的第四種物質(zhì)狀態(tài)，由大量的離子、電子以及中性粒子組成。等離子體是由于物質(zhì)分子熱運(yùn)動(dòng)相互碰撞使氣體分子電離出自由電子，電子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)中加速形成高能電子，進(jìn)而碰撞氣體分子使其電離，往復(fù)循環(huán)，最終形成大量中性粒子、離子和電子的混合物質(zhì)。由于電離過(guò)程中正離子帶的電荷和電子總是對(duì)應(yīng)出現(xiàn)，所以等離子體中正離子帶的電荷數(shù)和電子的總數(shù)大致相等，總體來(lái)看為電中性。反過(guò)來(lái)，可以把等離子體定義為：正離子和電子的電荷密度大致相等的電離氣體。

等離子體根據(jù)其粒子的溫度不同可分為高溫等離子體和低溫等離子體，高溫等離子體中所有粒子溫度都處于較高的溫度，而低溫等離子體中只有電子處于較高溫度，有較高的能量，其他粒子則處于常溫。根據(jù)其產(chǎn)生方式不同，等離子體可分為微波等離子體、射頻等離子體、介質(zhì)阻擋放電等離子體、電暈等離子體、電弧等離子體等。

等離子體誘變是在其滅菌原理基礎(chǔ)上，近幾年才起步發(fā)展的一種誘變方法。在誘變育種的應(yīng)用中，由于生物的熱敏性只能采用冷等離子體誘變，該方法既彌補(bǔ)了化學(xué)方法的高污染性和變異單一性，解決了傳統(tǒng)物理誘變法的遺傳不穩(wěn)定、變異率低等缺點(diǎn)。與近些年興起的離子注入誘變法相比，等離子體誘變技術(shù)對(duì)真空的要求不高，不會(huì)因真空產(chǎn)生的低溫或由離子束產(chǎn)生的高溫而使細(xì)胞失活，該誘變技術(shù)可以較大程度的提高細(xì)胞存活率，提高誘變效率，是一種適合于微生物誘變育種的技術(shù)。

1等離子體誘變?cè)?/p>

微生物的變異是指外界因素使細(xì)胞內(nèi)的DNA分子被破壞，使其大量的堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致在DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生基因突變，子代出現(xiàn)不同的基因型和表現(xiàn)型。冷等離子體中富含各種射線和粒子，等離子體誘變技術(shù)是通過(guò)對(duì)細(xì)胞有影響的光、荷電粒子和中性粒子等離子體對(duì)生物表層及遺傳物質(zhì)造成損傷、引發(fā)細(xì)胞修復(fù)，從而導(dǎo)致生物體表型和基因的改變。

在等離子體誘變中，射線和粒子對(duì)細(xì)胞表層造成的直接刻蝕作用。電子、自由基等對(duì)細(xì)胞壁造成直接損傷，改變細(xì)胞膜的通透性，從而使各種誘變因子易于進(jìn)入細(xì)胞而與DNA發(fā)生作用。電子具有較高的能量，但其能量碰到分子易損失，只能作用于細(xì)胞表層與細(xì)胞壁上的大分子，使其在一定程度上受損。各種活性氧自由基與細(xì)胞壁的大分子產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)效應(yīng)和生物效應(yīng)，也會(huì)對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)造成損傷。研究人員發(fā)現(xiàn)等離子體處理過(guò)的微生物胞內(nèi)蛋白和核酸濃度減少，而胞外溶液中蛋白和核酸濃度增加，這表明等離子體可以破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞表層造成直接刻蝕，這樣紫外線及各種粒子可以很容易地進(jìn)入細(xì)胞與胞內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)。

當(dāng)細(xì)胞的表層遭到破壞以后，進(jìn)入細(xì)胞的各種誘變因子與細(xì)胞中的DNA產(chǎn)生作用。冷等離子體對(duì)微生物DNA產(chǎn)生傷害及誘變效應(yīng)的可能原因有三種：（1）是紫外線直接照射DNA引起基因突變。對(duì)DNA有明顯傷害作用的紫外線波段是200-280nm，而等離子體中此波段的紫外線劑量不足，難以對(duì)DNA造成較大的傷害。（2）是原子通過(guò)紫外線照射與微生物DNA分子結(jié)合形成不穩(wěn)定化合物，造成微生物變異。在充入惰性氣體的等離子體中，原子在紫外照射下也難以與其他物質(zhì)反應(yīng)，也不會(huì)對(duì)DNA造成損傷，但會(huì)產(chǎn)生自由基，通過(guò)自由基對(duì)DNA分子造成損傷。（3）是活性氧自由基與微生物DNA分子產(chǎn)生氧化反應(yīng)，造成微生物變異。Mathieu Leduc等將裸露的DNA分別由充氦氣的介質(zhì)阻擋放電等離子體和大氣壓輝光等離子體炬處理后均會(huì)得到斷裂的DNA片段，并證實(shí)了活性氧自由基是造成DNA斷裂的主要因素。因此活性氧自由基是等離子體誘變的主導(dǎo)因素。

誘變過(guò)程中，活性氧自由基進(jìn)入細(xì)胞后，首先與DNA分子中的堿基或脫氧核糖發(fā)生反應(yīng)生成其它自由基，如胸腺嘧啶經(jīng)過(guò)氧化，生成胸腺嘧啶二羥基醇，鳥(niǎo)嘌呤被氧化后生成8-氧橋鳥(niǎo)嘌呤；導(dǎo)致DNA堿基被破壞，當(dāng)細(xì)胞中DNA分子中高密度長(zhǎng)片段發(fā)生損傷，會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制過(guò)程受到抑制，激發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制，即SOS修復(fù)，在DNA分子的復(fù)制受到抑制時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一種具有較低特異性的聚合酶、重組酶等。這些酶可催化損傷部位的DNA復(fù)制，使細(xì)胞得以存活，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配、DNA鏈斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致染色體重復(fù)、倒位、易位或缺失，使遺傳性質(zhì)發(fā)生較大變化，進(jìn)而易引發(fā)廣泛、長(zhǎng)期的突變，形成新的表現(xiàn)型和基因型。

2影響等離子體誘變的因素

影響等離子體誘變的因素可以分為兩類：一是等離子體產(chǎn)生的條件，包括氣體氣壓、氣流速率、組分或功率等）；二是誘變操作的條件（如誘變時(shí)間）。

等離子體中通入氣體的組分對(duì)等離子體產(chǎn)生自由基的種類影響很大，不同的氣體組分會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)，形成不同的自由基，如通入氫氣會(huì)產(chǎn)生氫自由基， 氧氣會(huì)產(chǎn)生氧自由基，水蒸氣會(huì)產(chǎn)生羥基自由基。Xianhui Zhang等在研究大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體對(duì)鏈球菌的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)通入氦氣和少量氧氣時(shí)產(chǎn)生氦、羥基和氧三種自由基，實(shí)驗(yàn)證明使鏈球菌失活的主要是羥基和氧自由基。由此可證明，氧氣在等離子體中產(chǎn)生活性氧自由基，這種活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的破壞作用是至關(guān)重要的。研究表明不同自由基的氧化性不同，對(duì)微生物的誘變效果也不同，如羥基自由基對(duì)大腸桿菌造成的傷害很小，而氧自由基和一氧化氮自由基對(duì)大腸桿菌造成的傷害較大，一氧化二氮自由基和過(guò)氧化物自由基對(duì)大腸桿菌造成的傷害更為明顯。即使同種自由基對(duì)于不同的微生物造成的傷害也有差異，羥基自由基對(duì)于大腸桿菌造成的傷害很小，而對(duì)鏈球菌造成的傷害很大。因此，某種或幾種能在等離子體中產(chǎn)生多種活性氧自由基的氣體組分對(duì)等離子體誘變起著積極的作用，選取氣體組分時(shí)也應(yīng)考慮對(duì)特定微生物的針對(duì)性。endprint

氣壓對(duì)等離子體誘變過(guò)程中細(xì)胞的存活率有一定影響，也會(huì)對(duì)活性氧自由基的濃度產(chǎn)生影響。可用于誘變的等離子體有低壓等離子體和大氣壓等離子體，一般氣體壓力低于1×103Pa的為低壓等離子體，主要用于輝光等離子體。由于低壓會(huì)造成細(xì)胞在未誘變之前死亡，也會(huì)降低等離子體產(chǎn)生自由基的濃度，從而影響誘變效果，因此現(xiàn)在大部分誘變利用大氣壓等離子體實(shí)現(xiàn)。然而低壓會(huì)使等離子體中電子的自由程增加，可能會(huì)產(chǎn)生氧化性更強(qiáng)的自由基，對(duì)誘變產(chǎn)生一定的正面影響。因此氣壓對(duì)誘變效果的影響還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

等離子體的功率對(duì)誘變的影響是間接的，功率是通過(guò)電子的能量和自由基的氧化性來(lái)使細(xì)胞變異的，功率的大小會(huì)直接影響電子的能量大小及活性氧自由基的形成，從能量的傳遞方面來(lái)講，功率越大對(duì)細(xì)胞的破壞就越強(qiáng)。Bo Yang等在研究大氣壓冷等離子體滅菌時(shí)，功率越高細(xì)菌存活率越低，功率達(dá)到15W時(shí)，只需處理9s，細(xì)菌死亡率就達(dá)100%。對(duì)于誘變來(lái)說(shuō)，需要找到一個(gè)合適的誘變功率，使致死率和正突變率均達(dá)到最佳的水平。

氣體的流速對(duì)于誘變的影響在于它能控制等離子體的形態(tài)和自由基的密度，而等離子體發(fā)光影像的形狀與其各部分的自由基密度有關(guān)。等離子體剛產(chǎn)生時(shí)離子化不穩(wěn)定，這會(huì)導(dǎo)致電荷收縮到電極表面，引起局部溫度升高，高溫會(huì)導(dǎo)致離子化程度更高，使整體的離子化程度不均一，而氣體的流動(dòng)會(huì)帶走多余的熱量使離子化穩(wěn)定。氣體流速過(guò)高又會(huì)帶走大量自由基，使活性氧自由基密度減小。J Goree等發(fā)現(xiàn)，等離子體發(fā)光影像在氣體低流速時(shí)為實(shí)心圓形，高流速時(shí)為環(huán)形，與高能電子的空間分布有關(guān)，發(fā)現(xiàn)氣體流速?zèng)Q定了自由基產(chǎn)生的位置。

誘變時(shí)間對(duì)等離子體誘變的影響非常明顯，一般誘變時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率就越低，夏書琴等利用大氣壓輝光放電冷等離子體對(duì)鏈霉菌孢子進(jìn)行誘變時(shí)，得到菌體致死率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，到6min時(shí)達(dá)100%。而董曉宇等人通過(guò)大氣壓冷等離子介質(zhì)阻擋放電法，對(duì)產(chǎn)1，3-丙二醇的克雷伯氏菌誘變，制得隨誘變時(shí)間增加細(xì)胞存活率下降的曲線，但細(xì)胞存活率下降到一定值會(huì)飽和，細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制的激活會(huì)導(dǎo)致存活率有所上升。由于誘變裝置和誘變菌種的差異，以上兩者的致死率隨時(shí)間變化的曲線稍有不同，然而其總體趨勢(shì)是一致的。

以上五種誘變因素都會(huì)不同程度地影響誘變效果，其中誘變時(shí)間和氣體組分有較系統(tǒng)的報(bào)道，而其他三種因素沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道，氣壓對(duì)誘變影響的有關(guān)文獻(xiàn)資料尤其少，因此這些有待于進(jìn)一步研究。等離子體誘變的裝置有多種，它們對(duì)于同種微生物誘變特點(diǎn)的比較也有待于進(jìn)一步研究。

3等離子體在生物領(lǐng)域的應(yīng)用前景

等離子體在生物領(lǐng)域有著一定程度的應(yīng)用。近幾年，等離子體誘變技術(shù)雖取得了階段性成果，得到了快速發(fā)展，但應(yīng)用并不廣泛。Yuan Lu等人利用大氣壓室溫等離子體誘變，制得突變體，其產(chǎn)氫量約1.134 molH2/ mol葡萄糖，是原菌株的126.4%倍。夏書琴等人也利用大氣壓輝光放電冷等離子體，對(duì)茂源鏈輪絲菌03-10進(jìn)行誘變，制得高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的突變株G2-1，酶活高達(dá)到2.73U/mL，是出發(fā)菌株的182% 倍，具有較穩(wěn)定的遺傳性。Xiufu Hua等人利用大氣壓常溫輝光等離子體對(duì)腸桿菌進(jìn)行誘變，制得耐鹽性腸桿菌（MU-1），其耐鹽性高達(dá)7.5%，是野生菌種的三倍多。董曉宇等人亦采用大氣壓冷等離子介質(zhì)阻擋放電法對(duì)產(chǎn)1， 3-丙二醇的克雷伯氏菌進(jìn)行誘變，制得突變株，其對(duì)甘油的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.57g/g，是野生菌株的158%倍。

等離子體誘變技術(shù)應(yīng)用用育種領(lǐng)域，相比于傳統(tǒng)技術(shù)，具有效率高，操作簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，但是作為一種創(chuàng)新性誘變方法，技術(shù)方面仍需探索，逐步完善，逐步成為可以得到廣泛應(yīng)用的誘變育種方法。

參考文獻(xiàn)

[1]菅井秀郎. 等離子體電子工程學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，OHM社， 2002.

[2]Mathieu Leduc et al. Effects of non-thermal plasmas on DNA and mammalian cells[J].Plasma Process.Polym，2010， （7）： 899909.

[3]夏書琴等. 大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010， 37（11）： 16421649.endprint