雷海容，張楓燃

(1.長春大學(xué) 科技開發(fā)研究中心，長春 130022；2.吉林職業(yè)技術(shù)學(xué)院圖書館，吉林 龍井 133400)

高純度大豆低聚肽制備及其醒酒機理的研究

雷海容1，張楓燃2

(1.長春大學(xué) 科技開發(fā)研究中心，長春 130022；2.吉林職業(yè)技術(shù)學(xué)院圖書館，吉林 龍井 133400)

利用風(fēng)味蛋白酶水解大豆分離蛋白制備高純度大豆低聚肽，分析其蛋白質(zhì)含量、肽含量、相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成等理化性質(zhì)。結(jié)果表明：高純度大豆低聚肽是極易溶于水的白色粉末，蛋白質(zhì)含量為93.6%，相對分子質(zhì)量分布≤1000的低聚肽成分含量占肽總量的87.15%，肽含量為91%，灰分為1.8%，水分為4.5%。高純度大豆低聚肽的醒酒機理是抑制乙醇在體內(nèi)的吸收，降低血液中乙醇濃度；同時具有良好的抗氧化活性，可有效增強清除超氧陰離子自由基及羥自由基能力，緩解乙醇代謝對人體的損害。

高純度大豆低聚肽；風(fēng)味蛋白酶；乙醇代謝；抗氧化活性；醒酒機理

中國制酒文化源遠(yuǎn)流長，滲透于整個中華五千年的文明史中，而且品種繁多，名酒薈萃。適量飲酒可以舒筋活血，對身體有益。然而，現(xiàn)代人相聚無酒不成席，經(jīng)常過量飲酒，會損害大腦、心臟、肝、胃、脾等器官，重度酒精中毒可使呼吸、心跳受抑制而死亡。近年來，酒駕更是造成許多車禍的原因。

大豆肽是指大豆粕或大豆蛋白經(jīng)酶解或微生物發(fā)酵，產(chǎn)生的相對分子質(zhì)量在5000以下肽的粉末狀物質(zhì)[1]。高純度大豆低聚肽是經(jīng)過蛋白酶解、分離和精制得到的色澤純白、無異味的白色粉末，其蛋白質(zhì)含量≥90%，相對分子質(zhì)量分布≤1000的低聚肽成分含量≥85%，肽純度≥90%，溶解度=100%、灰分≤2.0%、NSI值=100%[2]。研究表明：大豆低聚肽具有抗疲勞[4]、提高機體免疫力[5]、降低人體血壓[6]、降血清膽固醇[7]、促進脂質(zhì)代謝[8]、調(diào)節(jié)血糖[9]、調(diào)節(jié)腸道[10]等多種生理功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI)：通榆縣益發(fā)合大豆制品有限公司。肽相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(甘氨酸-酪氨酸相對分子質(zhì)量為239.2，纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸相對分子質(zhì)量為379.5。蛋氨酸腦啡肽相對分子質(zhì)量為573.23。亮氨酸腦啡肽相對分子質(zhì)量為555.63～569.65。血管緊張素Ⅱ相對分子質(zhì)量為1296)：美國Sigma公司。乙腈、三氟乙酸：色譜純，美國Tedia公司。茚三酮溶液(20g茚三酮、苯酚2g用鉀鈉緩沖鹽400mL和甲醇600mL溶解)：國產(chǎn)分析純。CAD-40型大孔吸附樹脂：鄭州勤實科技有限公司。風(fēng)味蛋白酶(食用級)：諾維信生物技術(shù)有限公司。粉末活性炭、硅藻土：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。其他試驗均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

L-8800型氨基酸分析儀：日本日立公司。真空泵：海門市華豐真空設(shè)備有限公司。高效液相色譜儀：美國戴安Dionex Summit公司。實驗室小型板框壓濾機：上海信步科技有限公司；不銹鋼微孔過濾器(φ100mm)：上海凈密過濾設(shè)備有限公司；小型噴霧干燥機：山東天力；小型電滲析器(100mm×200mm)：蘇州依斯倍環(huán)保裝備科技有限公司。玻璃吸附柱(φ30mm×300mm)：北京滿倉科技有限公司。DK-98-11A型電熱恒溫水浴鍋(4孔)：天津市泰斯特儀器有限公司。FA2204B型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。XL-1型馬弗爐：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高純度大豆低聚肽的制備方法

目前，酶法是較常用的大豆肽的制備方法。其反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高、不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸，產(chǎn)品純度及安全性高，無副作用[11]，產(chǎn)物易分離。風(fēng)味蛋白酶水解SPI，可以脫除水解液的苦味[12]。因此，本文采用風(fēng)味蛋白酶水解大豆分離蛋白制取高純度大豆低聚肽。制備工藝按[3]所述方法。

1.3.1.1 工藝流程

大豆分離蛋白→溶解→水解→殺菌滅酶→酸沉→過濾分離→脫鹽→提純→濃縮→脫色、脫味→噴霧干燥→高純度大豆低聚肽

1.3.1.2 具體操作要點

(1)溶解蛋白：將SPI按固液比1:20放入恒溫水浴中攪拌，攪拌速度為40r/min，水溫保持在55℃，攪拌50min。SPI的主要成分為7S和11S球蛋白，不易溶解。溶解蛋白時需要邊投入邊攪拌，同時熱處理。攪拌50min時的溶解度比未經(jīng)處理的SPI溶液提高1.5倍[13]。

(2)水解SPI：加入風(fēng)味蛋白酶，加酶量為SPI重量的4%，水溫仍保持55℃，繼續(xù)攪拌4h。酶解溫度和酶解時間是影響大豆低聚肽溶出率的重要因素。55℃為水解大豆低聚肽最佳溫度[14]。為防止水解液變質(zhì)，酶解時間以4h為宜。

(3)殺菌滅酶：將酶解后的蛋白液在90℃條件下進行加熱攪拌30min，使酶失活，然后降溫至40℃以下。風(fēng)味蛋白酶最適溫度不能超過60℃，當(dāng)溫度達到60～80℃時，酶活性被破壞，發(fā)生不可逆變性。因此，滅酶溫度確定在90℃。

(4)酸沉：添加1O%的HCl調(diào)至大豆蛋白等電點pH4.2～pH4.5，在攪拌50r/min條件下使未酶解的大豆蛋白呈凝乳狀析出。SPI在pH4.2～pH4.5之間全部沉淀，而大豆低聚肽卻在此酸性條件下完全溶解。因此，可以把未酶解的SPI沉析出來。

(5)過濾分離：將經(jīng)等電酸沉處理的混合液送入板框壓濾機，壓強為0.1MPa～1.0MPa，流速為1000L/h，助濾劑為硅藻土。使混合液經(jīng)過濾分離所得的酶解大豆肽液均已達到透明水平為度，留濾液，棄濾餅。板框壓濾機是固液分離的一種設(shè)備，除考慮去除酶解大豆肽液中殘留的非水溶性的固形物外，還需選用硅藻土作為深層過濾助濾劑過濾大豆肽液混有的雜質(zhì)沉淀、細(xì)菌及其它微生物。

(6)電滲析脫鹽：電滲析裝置的進料泵壓強為0.2MPa，電流為18A～20A，溶液通過后，物料的電導(dǎo)率應(yīng)在200μs/cm左右。由于蛋白水解物中含有一定數(shù)量的離子型雜質(zhì)，這部分雜質(zhì)會影響到產(chǎn)品的純度和適用范圍，需要對大豆肽液進行脫鹽處理。

(7)樹脂提純：將預(yù)處理后充分溶脹的非極性CAD-40型吸附樹脂采用常規(guī)濕法裝柱，不得帶入氣泡，并且使樹脂均勻填充。再將脫鹽后的淡黃色液體送入樹脂柱裝置中，通過樹脂柱的液相物為高純度大豆低聚肽溶液。

(8)反滲透濃縮：將樹脂吸附后流出的液體經(jīng)φ≤10-10的反滲透膜，流出液為純水，以大豆低聚肽為主要成分的溶液濃度約為10%。反滲透膜的膜孔徑非常小，因此能夠有效地去除溶液中的膠體、微生物等。同時施加一個超過滲透壓的反壓力時，大豆肽液被迫通過半透膜，無需化學(xué)品即可達到濃縮的目的。

(9)活性炭脫色、脫味：按溶液量的2%加入活性炭，攪拌30min，再將混有活性炭的溶液送入板框壓濾機，在壓強≤3.5Kg/cm2的條件循環(huán)過濾，至濾液呈無色，留濾液，棄濾餅。大豆蛋白酶解液通常呈現(xiàn)棕黃色或褐色，其中含有酚類物質(zhì)以及多種色素分子[15]；另外，大豆肽液由于長時間加熱，其中殘留的糖類也可能發(fā)生焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)，也可加深大豆肽液的顏色。由于活性炭的吸附性能，不僅可以脫色，還可以脫除大豆肽液中的異味。

1.3.2 高純度大豆低聚肽樣品的檢測方法

大豆肽含量按GB/T 22492-2008檢測；蛋白質(zhì)含量分析采用凱氏定氮法按GB/T 5009.5-2003執(zhí)行；水分含量按GB/T 5009.3-2003食品中水分的測定法-直接干燥法測定；灰分含量按GB/T 5009.4-2003執(zhí)行；相對分子質(zhì)量分布采用高效液相色譜儀分析，按《“大豆肽粉”國家標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 22492-2008)執(zhí)行；氨基酸組成測定采用氨基酸分析儀進行測定，按《食品中氨基酸的測定國家標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T5009.124-2003)執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀與理化指標(biāo)結(jié)果

高純度大豆低聚肽色澤純白，無苦、澀、腥、臭味，極易溶于水。蛋白質(zhì)含量為93.6%，肽含量為91%，灰分為1.8%，水分為4.5%。

2.2 相對分子質(zhì)量分布

分別用流動相制成不同相對分子質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用孔徑0.45μm聚四氟乙烯膜過濾后進樣，得到系列標(biāo)準(zhǔn)肽的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(1gMv)對保留時間作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和校正曲線方程。如圖1所示。

作為化工園區(qū)一體化配套服務(wù)企業(yè)，上?；^(qū)中法水務(wù)發(fā)展有限公司的智慧水務(wù)是園區(qū)生產(chǎn)性服務(wù)業(yè)的一大亮點。據(jù)公司副總經(jīng)理邵偉介紹，智慧水務(wù)以獨特的污水處理模式，全過程的污水水質(zhì)監(jiān)控，為企業(yè)提供量身定制的水處理服務(wù)。據(jù)介紹，目前公司運營著一個供水能力為20萬t/d的工業(yè)水廠、一套供水能力為7000 t/d的生活水裝置和一個供水能力為280 m3/h的脫鹽水廠。同時還運營一個擁有多套生化處理裝置，能夠處理水質(zhì)復(fù)雜的高濃度污水的污水處理廠，處理能力達到4.45萬m3/d，為園區(qū)內(nèi)用戶提供全天候不間斷的供水及污水處理服務(wù)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)肽相對分子質(zhì)量對數(shù)與色譜保留時間標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 低聚肽樣品的高效凝膠滲透色譜圖

對大豆低聚肽進行高效凝膠滲透色譜分析，圖譜如圖2所示。再用GPC數(shù)據(jù)處理軟件計算得到不同肽段相對分子質(zhì)量分布情況，如表1所示。

表1 大豆低聚肽樣品的相對分子質(zhì)量分布

由表1可知：大豆低聚肽樣品組分的相對分子質(zhì)量均小于2600，主要集中在128～1000之間，占肽總量的81.01%；相對分子質(zhì)量小于1000的低聚肽占肽總量的87.15%，含量小于128的組分含有非大豆肽組成成分的氨基酸。

2.3 組分氨基酸含量

大豆低聚肽經(jīng)定容、蒸發(fā)、超聲溶解，通過0.45μm膜后的測定結(jié)果如表2所示。氨基酸總量為85.64g/100g，氨基酸組成合理且含量豐富,含有人體必需的8種氨基酸。

表2 氨基酸含量

3 高純度大豆低聚肽的醒酒機理

3.1 酒精在人體內(nèi)的吸收與代謝

酒精從口腔經(jīng)胃進入腸，5min就可通過毛細(xì)血管壁進行擴散，迅速分布到人體各個部位，30min～60min時，血液中乙醇濃度就可達到最高點。吸收酒精量最大的是十二指腸，大約可以吸收80%，其次是胃，吸收量最少的是口腔[16]。另外，吸收酒精的速度除跟是否空腹、食物、胃壁情況及酒精含醇量等有關(guān)外，還存在較大的個體差異，酒精吸收速度在個體間相差2～3倍[17]，這種差異是遺傳和環(huán)境因素綜合作用的結(jié)果。

進入體內(nèi)的酒精只有不足10%沒有氧化分解而直接以原形經(jīng)尿液、汗液及呼吸道排出體外，其余的都是經(jīng)胃或肝臟中的酶系統(tǒng)進行代謝，將酒精氧化為乙醛。其中，90%以上酒精是在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的催化作用下完成代謝的。另外，還有微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)及過氧化氫酶(CAT)清除自由基系統(tǒng)[18]。

酒精的代謝絕大部分是在肝臟處進行的，分別在肝細(xì)胞質(zhì)液和肝微粒體中代謝。在肝細(xì)胞質(zhì)液中代謝需要輔酶(NAD+)參與和乙醇脫氫酶的催化；在肝微粒體中進行代謝的稱為微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)，需要細(xì)胞色素P450的存在和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的參與[19]。MEOS僅占肝內(nèi)乙醇氧化量的20%，但長期飲酒及高濃度酒精則由MEOS氧化。生成的乙醛再由乙醛脫氫酶代謝為乙酸。這些乙酸除小部分在肝臟被利用外，大部分由肝臟輸送到全身各部位，最后被分解為H2O和CO2，同時釋放大量能量。乙醇代謝過程中會積累大量的自由基，如O2·-、·OH、H2O2及C2H50-等[19]。由于自由基最外層電子軌道上帶有單個電子，所以極不穩(wěn)定，易與其他原子基團結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。這些過量的自由基刺激神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致自律神經(jīng)平衡失調(diào)，引起血液中水分與電解質(zhì)平衡失調(diào)[20]，表現(xiàn)為心跳加速、頭暈?zāi)垦?、局部皮膚過敏、腸胃不適等酒后癥狀。

3.2醉酒對人體的危害

被吸收的酒精積聚在血液和人體組織中，腦組織的酒精濃度是血液的10倍，血液中酒精濃度如超過300mg/100mL可導(dǎo)致昏迷或死亡。大量飲酒后還會引起血壓下降，嚴(yán)重時會因呼吸中樞麻痹引發(fā)窒息而死。長期過量飲酒容易產(chǎn)生脂肪肝，心臟及其他肌肉功能衰退，也可能造成胃炎、胃潰瘍及胰腺炎，甚至骨質(zhì)疏松、高尿酸血癥、低血糖癥[17]。

3.3 高純度大豆低聚肽的解酒防醉功效

3.3.1 抑制乙醇在人體血液中的吸收

乙醇通過減少從肌肉中釋放丙氨酸來降低血液中丙氨酸濃度。所以，提高血液中丙氨酸濃度，可以使氨基及含碳物從肌肉轉(zhuǎn)化到肝臟，補充足夠的輔酶(NAD+)，加速將乙醇分解轉(zhuǎn)化為乙酸，在人體正常的三羧酸循環(huán)過程中，被利用或分解后排出體外。亮氨酸比丙氨酸更具解酒功能，快速飲酒影響腦中的氨基酸平衡，而產(chǎn)生骨骼肌異常收縮反應(yīng)。及時補充亮氨酸，可使腦中氨基酸組成恢復(fù)正常，改善骨骼肌異常收縮，并產(chǎn)生作為肌肉中轉(zhuǎn)化為丙酮酸的氨基。此外，谷氨酸、脯氨酸和精氨酸也對酒精代謝有影響[21]。

高純度大豆低聚肽具有快速被人體吸收的特性。動物口服攝入后，給藥5min在血液中即可測出，10min達到血藥峰值，半衰期為12h，表明高純度大豆低聚肽不需要經(jīng)過動物消化與酶解，攝入后通過消化吸收系統(tǒng)器官可直接快速進入血液[22]。并且食用劑量增大至人體正常攝入量的250倍時，未見臨床癥狀與死亡現(xiàn)象，因此，確定高純度大豆低聚肽無毒，具有食用安全性[9]。由于高純度大豆低聚肽相對分子質(zhì)量≤1000的成分含量占肽總量的87.15%(見表1)，主要成分是二肽及三肽[23]，所以，經(jīng)代謝降解為組分氨基酸的周期要短于普通大豆蛋白與多聚肽，更利于人體吸收。服用低聚肽后降解生成的氨基酸可維持人體正常平衡，尤其是提高血液中亮氨酸與丙氨酸的濃度，輔酶(NAD+)得到足夠補充，三羧酸循環(huán)活動維持正常，血液中乙醇濃度得到抑制。

3.3.2 有效增強清除自由基能力

·OH是毒性最大的自由基，由于活潑，所以破壞糖類、磷脂及有機酸等分子的速度極快。大豆低聚肽具有抑制·OH的能力[26]。O2·-是人體發(fā)生氧中毒的主要原因，主要表現(xiàn)在膜損傷、線粒體氧化磷酸化及其他變化。肝臟損傷就是O2·-過量引起的[20]。超氧化物歧化酶(SOD),可清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量O2·-，將其轉(zhuǎn)化成H2O2和O2除去，使細(xì)胞免受損傷。通過灌服大豆低聚肽，可提高動物的肝臟組織中SOD的活力，證明大豆低聚肽具有良好的抗氧化活性[25]。肽的抗氧化活性與其氨基酸組成有關(guān)[27]，大豆低聚肽中的許多氨基酸具有抗氧化活性，如賴氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸等，以上幾種氨基酸總量為32.36g/100g(見表2)。這是高純度大豆低聚肽具有一定的抗氧化活性另一佐證。

因此，高純度大豆低聚肽具有提高清除O2·-及·OH兩種自由基的能力，可以減慢自由基反應(yīng)，減輕酒后不適癥狀。

4 結(jié)論

利用風(fēng)味蛋白酶水解SPI制備的高純度大豆低聚肽，是極易溶于水的白色粉末，其蛋白質(zhì)含量為93.6%，相對分子質(zhì)量分布≤1000的低聚肽成分含量占肽總量的87.15%，肽含量為91%，灰分為1.8%，水分為4.5%。

根據(jù)乙醇在體內(nèi)的代謝過程，利用高純度大豆低聚肽富含氨基酸、吸收快的特點，可抑制乙醇在體內(nèi)的吸收，降低血液中乙醇濃度，同時具有良好的抗氧化活性，可清除乙醇代謝過程中產(chǎn)生的過量O2·-及·OH自由基，可使人體組織免受氧化損傷。飲酒前服用高純度大豆低聚肽可保護人體組織免受氧化損傷，緩解乙醇代謝帶來的頭痛、惡心及腸胃不適等酒后癥狀，起到醒酒的作用。攝入高純度大豆低聚肽可望對乙醇代謝產(chǎn)生積極影響。

[1] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T22492-2008，“大豆肽粉”國家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

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責(zé)任編輯：程艷艷

ResearchonPreparationofHighlyPurifiedSoybeanOligopeptidesandItsAlcoholMetabolismMechanism

LEI Hairong1，ZHANG Fengran2

(1. Science and Technology Development Research Center, Changchun University，Changchun 130022, China; 2. Library, Jilin Vocational and Technical College, Longjing 133400, China)

Flavored proteinase is used to prepare highly purified soybean oligopeptides by hydrolysis of soybean protein isolate, and the physical and chemical properties of the protein content, peptide content, relative molecular mass distribution and amino acid composition are analyzed. The results show that the highly purified soybean oligopeptides, white powders with 93.6% protein, are easily soluble in water，the oligopeptide content of relative molecular mass distribution ≤ 1000 accounts for 87.15% of the total peptide, the peptide content is 91%, the ash content is 1.8%, and the moisture content is 4.5%. The alcohol metabolism mechanism of highly purified soybean oligopeptides is to inhibit the absorption of alcohol in organism and reduce ethanol concentration in blood. Highly purified soybean oligopeptides exhibits good antioxidant activities, which can effectively enhance the ability to remove superoxide anion radicals and hydroxyl radicals and reduce organism damage caused by alcohol metabolism.

highly purified soybean oligopeptide; flavor protease； alcohol metabolism; antioxidant activity；alcohol metabolism mechanism

2017-06-05

雷海容(1972-)，女，廣西南寧人，工程師，碩士，主要從事食品加工與安全方面研究。

R15

A

1009-3907(2017)10-0022-06